РОССИЙСКИЙ ИММУНОЛОГИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ, 2015, том 9(18), № 1, с. 114-117
КРАТКОЕ СООБЩЕНИЕ
РЕГУЛЯЦИЯ ЛЕПТИНОМ И ГРЕЛИНОМ СОЗРЕВАНИЯ ДЕНДРИТНЫХ КЛЕТОК И ПРОДУКЦИИ ЦИТОКИНОВ
© 2015 г. Е.Г. Орлова, С.В. Ширшев, О.А. Логинова
Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН, 614081 г. Пермь, ул. Голева, 13
Поступила: 12.10.2014. Принята: 15.01.2015
Изучено влияние лептина и грелина, и их комбинаций в концентрациях, отражающих уровень гормонов в периферической крови при беременности, на экспрессию поверхностных молекул и продукцию цитокинов дендритными клетками, генерированными из моноцитов периферической крови. Установлено, что лептин, грелин, а также их комбинация, в концентрациях, характерных для беременности, не влияют на экспрессию поверхностных маркеров ДК (НЬЛ-ОЯ, С083, С086), отражающих степень их зрелости, но модулируют продукцию ключевых цитокинов. Лептин усиливает выработку 1Ь-12р70, но не влияет на синтез ТСБ-р1. Тогда как грелин, напротив, повышает выработку ТСБ-р1, но не влияет на продукцию 1Ь-12р70. Сочетанное действие гормонов нивелирует их самостоятельные эффекты на продукцию цитокинов. Таким образом, лептин и грелин являются значимыми регуляторами функциональной активности дендритных клеток периферической крови.
Ключевые слова: лептин, грелин, дендритные клетки
Пептидные гормоны — лептин и грелин, являются антагонистами в регуляции пищевого поведения, метаболизма жировой ткани и энергетического гомеостаза [1]. Оба гормона обладают выраженной иммунорегуля-торной активностью и играют важную роль в реализации репродуктивных процессов. При беременности уровень гормонов значительно нарастает и варьирует по триместрам [2, 3]. Иммунная система матери в процессе беременности характеризуется толерантностью к фетальным антигенам на фоне сохранения защитных свойств к другим чужеродным агентам в целом [4]. Известно, что нарушения жирового обмена сопряжены с репродуктивными проблемами иммунного генеза, как бесплодие, привычное невынашивание, причиной чему является нарушение формирования иммунной толерантности [1]. Дендритные клетки (ДК) являются основными антиген-презентирующими клетками, а цитокины, продуцируемые ДК, определяют направленность дифференцировки СБ4+ Т-хелперных клеток (Тк), и дальнейшее развертывание адаптивного иммунного ответа, либо индук-
Адрес: 614081 г. Пермь, ул. Голева, 13, Орловой Екатерине Григорьевне. E-mail: orlova_katy@mail.ru
цию Т-клеточной толерантости [5]. Моноциты периферической крови, предшественники миелоидных ДК, экспрессируют рецепторы как к лептину, так и к грелину [6]. Следует отметить, что основные исследования иммуно-модулирующего действия лептина и грелина проводились на мышах в моделях ожирения, воспаления и аутоиммунных патологий. Показано, что лептин активирует ДК, усиливая их миграцию, и стимулируя ТЫ иммунный ответ [6], а грелин значимо регулирует функциональную активность моноцитов [8], хотя его эффекты на ДК не изучены. Все вышесказанное позволяет предполагать значимую роль лептина и грелина в регуляции созревания и функциональной активности ДК при беременности.
Цель работы — исследовать эффекты лептина, грелина и их физиологических сочетаний, в концентрациях, характерных для беременности, на созревание и продукцию цитокинов ДК.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ
Объектами исследования являются ДК, генерированные из моноцитов периферической крови здоровых небеременных женщин
репродуктивного возраста. Забор крови осуществляли в фолликулярную фазу менструального цикла. Суспензию мононуклеаров (МПК) выделяли из гепаринизированной крови центрифугированием в градиенте плотности фиколл-верографина (1,077 г/см3). Генерацию ДК проводили по стандартной методике [7]. Выделенные МПК ресуспен-дировали в полной питательной среде (ППС) (среда RPMI-1640, содержащая 10% эмбриональной телячьей сыворотки, 1 мМ буфера HEPES, 2 мМ L-глутамина, 100 ед/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина). Суспензию МПК (1 — 5 • 106/мл) засевали на 24-лу-ночные планшеты («Costar», USA) по 2 мл на лунку и инкубировали в течение 3 часов при 37 °С в атмосфере с 5% СО2. За это время моноциты адгезировались к поверхности пластика. Неприлипшие клетки смывали с поверхности пластика средой RPMI-1640. Далее в лунки вносили ППС и гормоны. Лептин («Sigma», США) использовали в концентрации 35 нг/мл, которая отражает его содержание в периферической крови во II — III триместрах беременности [2]. Грелин («Sigma», Израиль) использовали в концентрации 1,25 нг/мл, сопоставимой с уровнем гормона в периферической крови в I — II триместрах беременности [3]. Для исследования совместных эффектов гормоны в культуры вносили одномоментно в сочетании, характерном для беременности (лептин 35 нг/мл + грелин 1,2 нг/мл). Выбор концентраций гормонов обусловлен ранее проведенными исследованиями, поскольку именно эти концентрации гормонов оказывали наиболее выраженные эффекты [8, 9]. В контрольные пробы вместо гормонов добавляли физиологический раствор, используемый для их растворения.
Для индукции формирования ДК во все пробы кроме контроля добавляли GM-CSF (100 нг/мл, R&D, USA), а также IL-4 (20 нг/мл, BioLegend, USA) [6, 7]. Клетки инкубировали при 37 оС в условиях 5% СО2 в течение 5 суток. По окончании третьих суток меняли часть среды и повторно добавляли те же цитокины, а также вносили индуктор созревания ДК — ЛПС (1 мкг/мл, Escherichia coli serotype 0111 : B4, Sigma) [6, 7]. По окончании 5-х суток собирали супернатанты. ДК снимали с пластика пипетированием, дважды отмывали их в RPMI-1640 и оценивали фенотип методом проточной цитометрии. Степень зрелости определяли по экспрессии поверхностных молекул CD14, CD80, CD83,
НЬЛ-БК. Окрашивание осуществляли согласно методике производителя моноклональных антител («еВюваепсе», США). Для контроля неспецифического связывания использовали соответствующие изотипические контроли. Регуляторные свойства формирующихся ДК анализировали, определяя концентрацию ТСР-^1 («еВюваепсе» США) и 1Ь-12р70 (Вю1едеп^ США) в супернатантах культур методом иммуноферментного анализа с использованием коммерческих наборов согласно инструкции производителя.
При статистической обработке результатов вычисляли среднюю арифметическую величину и ее стандартную ошибку. Поскольку выборочное распределение данных, оцениваемое по критерию Фишера, было нормальным, достоверность различий между средними величинами оценивали по парному ^критерию Стьюдента.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Чтобы оценить эффективность генерации ДК в качестве контроля использовали пробы без внесения индукторов (1Ь-4 и СМ-СБР). Установлено, что моноциты, культивируемые без 1Ь-4 и СМ-СБР в течение 5 суток, имели достоверно высокий уровень экспрессии СБ14 — общего моноцитарного маркера (моноциты — 80,6 ± 22,4, контроль — 23,4 ± 10,2; р < 0,05). Количество НЬЛ-БИ также было высоким, но достоверно ниже, чем на формирующихся ДК (моноциты — 60,1 ±18,2, контроль — 81,3 ± 13,9; р < 0,05). Тогда как уровень костимулирующих молекул СБ83 (моноциты — 7,6 ± 0,1, контроль — 50,2 ± 6,6; р < 0,05) и СБ86 (моноциты - 29,1 ± 1,9, контроль — 63,4 ± 19,2; р < 0,05) на моноцитах был достоверно ниже, чем на созревающих ДК. Культивирование моноцитов в присутствии 1Ь-4, СМ-СБР и ЛПС приводит к появлению типичного фенотипа ДК — низкой экспрессии СБ14, высокой экспрессии НЬЛ-БИ, СБ83 и СБ86, что свидетельствует о генерации ДК (табл.).
При оценке влияния лептина и грелина в концентрациях, отражающих уровень гормонов в периферической крови при беременности, на экспрессию ДК молекул, участвующих в презентации антигенов (НЬЛ-БИ), а также костимулирующих молекул (СБ83, СБ86) модулирующих эффектов выявлено не было (табл.). Таким образом, гормоны в исследуемых концентрациях не влияют на фенотипи-ческое созревание ДК.
116
Е.Г. Орлова и др.
Таблица. Влияние лептина и грелина на экспрессию поверхностных маркеров ДК и продукцию
цитокинов in vitro
Гормоны CD14 + (n = 6) HLA-DR+ (n=10) CD83+ (n = 5) CD86 + (n=11) IL-12p70, пг/мл (n=10) TGF-P1, пг/мл (n=10)
Контроль 23,4±10,2 81,3±13,9 50,2 ± 6,6 63,4 ± 19,2 20,2±6,1 57,5±13,6
Лептин, 35 нг/мл 24,6± 10,4 84,1±13,4 50,5 ± 13,4 70,3 ± 20,1 24,0±6,8* 48,3±4,9
Лептин, 35 нг/мл + Грелин, 1,25 нг/мл 20,4±14,0 80,7±16,0 52,0 ± 22,5 65,6 ± 15,6 23,6±7,5 59,9±9,0
Грелин, 1,25 нг/мл 15,3±9,6 80,7±13,1 45,8 ± 13,7 68,6 ± 18,0 21,1±6,3 70,7±8,4*
Примечание: *достоверные отличия с контролем (p < 0.05) по парному t-критерию Стьюдента
Поскольку спектр вырабатываемых ДК цитокинов определяет направленность диф-ференцировки Т-клеток и развитие иммунного ответа в целом, важно было оценить влияние гормонов на продукцию ключевых цитокинов. Установлено, что лептин усиливает выработку 1Ь-12р70, но не оказывает влияния на синтез ТСБ-р1 (табл.). Тогда как грелин, напротив, усиливает выработку ТСБ-р1, но не влияет на продукцию 1Ь-12р70. Действуя совместно, лептин и грелин в комбинации, характерной для беременности, не влияют на выработку 1Ь-12р70 и ТСБ-р1 созревающими ДК. Таким образом, лептин и грелин являются значимыми регуляторами функциональной активности дендритных клеток.
В результате проведенных исследований показано, что лептин и грелин, в концентрациях, характерных для беременности, в присутствии ЛПС не влияют на экспрессию поверхностных маркеров ДК, отражающих степень их зрелости, но модулируют продукцию ключевых цитокинов. Лептин, усиливая продукцию 1Ь-12р70, проявляет провоспали-тельную активность, способствуя ТЫ-при-мированию ДК. Грелин, напротив, усиливая продукцию ТСБ-р1, будет способствовать проявлению толерогенных свойств ДК. Совместное действие гормонов нивелирует их самостоятельные эффекты. Таким образом,
возможно, что роль лептина и грелина в формировании периферической толерантности при беременности обусловлена не только их участием в индукции формирования Трег [10], но и в регуляции толерогенных свойств дендритных клеток.
Работа поддержана грантом РФФИ № 13-04-00571А
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1.
Tena-Sempere M. Neuroendocrinol. 2007, 86, 229-241.
2. Hardie L., Trayhurn P., Abram
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.