БИОХИМИЯ, 2006, том 71, вып. 2, с. 266 - 274
УДК 577.15
РЕГУЛЯЦИЯ МЕТАБОЛИЗМА 2-ОКСОГЛУТАРАТА ПОД ДЕЙСТВИЕМ ^БР-ИЗОЦИТРАТДЕГИДРОГЕНАЗЫ И АСПАРТАТАМИНОТРАНСФЕРАЗЫ В ПЕЧЕНИ КРЫСЫ
© 2006 г. Т.И. Рахманова*, Т.Н. Попова
Кафедра аналитической и медицинской биохимии и микробиологии Биолого-почвенного факультета Воронежского государственного университета, 394693Воронеж, Университетская площадь, 1; факс: (0732)208-755, электронная почта: rtyana@mail.ru
Поступила в редакцию 21.07.04.
Исследованы кинетические и регуляторные свойства МАЭР-изоцитратдегидрогеназы (МАЭР-ИДГ, КФ 1.1.1.42) и аспартатаминотрансферазы (АсАТ, КФ 2.6.1.1), обеспечивающие особенности метаболизма 2-оксоглутарата в цитоплазматической и митохондриальной фракциях печени крысы. Субклеточная локализация этих ферментов и кинетические параметры (Кт, Кй), полученные с использованием высокоочи-щенных ферментных препаратов, позволяют предположить, что основную роль в синтезе 2-оксоглутарата играет цитоплазматическая МАЭР-ИДГ, на долю которой приходится 86% от общей активности в клетке, а в утилизации —цитоплазматическая АсАТ (78% от общей активности). Характерным свойством АсАТ из печени крысы является субстратное ингибирование, а также изменение сродства фермента к субстратам под действием некоторых интермедиатов цикла трикарбоновых кислот (ЦТК) — изоцитрата, сукцината, фума-рата и цитрата. В регуляции МАЭР-ИДГ и АсАТ принимают участие ключевые интермедиаты азотного обмена — глутамат, глутамин и аспартат. Регуляция этих ферментов часто имеет разнонаправленный характер, за счет чего возможна активация каталитического действия одного фермента при одновременном снижении активности другого. Очевидно, контроль углеродного и азотного метаболизма в печени крысы может осуществляться путем распределения 2-оксоглутарата между различными метаболическими процессами с помощью регуляторных механизмов, воздействующих на активности различно локализованных форм МАЭР-ИДГ и АсАТ.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: печень крысы, 2-оксоглутарат, МАЭР-изоцитратдегидрогеназа, аспартатаминотранс-фераза, регуляция.
Реакции азотного обмена тесно связаны с углеродным метаболизмом, так как основными источниками углеродных скелетов аминокислот служат интермедиаты гликолиза, цикла трикарбоновых кислот (ЦТК) и пентозофосфатного пути. Считают, что из всех интермедиатов, поставляющих углеродные скелеты для биосинтеза аминокислот, 2-оксоглутарат играет главную роль, так как является наиболее активным промежуточным акцептором аминогрупп [1, 2]. От степени обеспечения процессов переаминиро-вания данным метаболитом зависит скорость протекания реакций азотного обмена.
Существуют различные 2-оксоглутарат-син-тезирующие ферменты, локализованные в раз-
Принятые сокращения: МАЭР-ИДГ — МАЭР-изо-цитратдегидрогеназа, МАЭР-ИДГ-реакция — МАЭР-изо-цитратдегидрогеназная реакция, АсАТ — аспартатамино-трансфераза, АсАТ-реакция — аспартатаминотрансфераз-ная реакция, СДГ — сукцинатдегидрогеназа, ЛДГ — лак-татдегидрогеназа, ЦТК — цикл трикарбоновых кислот.
* Адресат для корреспонденции и запросов оттисков.
ных компартментах клетки, и до настоящего времени остается неизвестным, какая именно ферментативная реакция является основной в синтезе 2-оксоглутарата в клетках растений и животных. Предполагается, что главную роль играют реакции, катализируемые МАЭР-изо-цитратдегидрогеназой (МАЭР-ИДГ, КФ 1.1.1.42) и аспартатаминотрансферазой (АсАТ, КФ 2.6.1.1) [2—4]. Но несмотря на наличие большого количества данных о структуре и каталитических свойствах МАЭР-ИДГ и АсАТ [5—9], их участие в координации процессов углеродного и азотного обмена путем регуляции превращений 2-ок-соглутарата в различных субклеточных компа-ртментах остается невыясненным. В связи с недостаточностью сведений о регуляции активностей МАЭР-ИДГ и АсАТ в настоящее время отсутствуют представления о механизмах, обеспечивающих возможность координации функционирования этих ферментов, хотя, по всей видимости, такие механизмы должны существовать в клетке.
В этой связи целью данной работы являлась сравнительная характеристика кинетических и регуляторных свойств различно локализованных форм МАОР-ИДГ и АсАТ из печени крысы, позволяющая выявить возможные механизмы координации их функционирования, что имеет значение для понимания путей сопряжения и регуляции углеродного и азотного обмена.
МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
В качестве объекта исследования использовали лабораторных белых крыс (ЯаШз тИш Ь.), самцов массой 250—300 г. Животных содержали на стандартном рационе питания в виварии. Печень, используемую в ходе исследования, извлекали под наркозом после многократного перфу-зирования ледяным физиологическим раствором [10].
Активность ферментов определяли спектро-фотометрически (X = 340 нм). Реакционная среда для определения активности МАОР-ИДГ содержала 0,05 мМ 1ш-НС1-буфер, рН 7,8, 1,5 мМ изоцитрат, 2 мМ МпС12 и 0,3 мМ МЛБР. О скорости ИДГ-реакции судили по возрастанию оптической плотности в результате восстановления МЛБР.
О скорости прямого трансаминирования под действием АсАТ судили по уменьшению оптической плотности в результате окисления МЛОН в системе сопряженных ферментативных реакций, включающих в себя образование оксалоацетата под действием АсАТ и его последующее превращение под действием малатде-гидрогеназы [11, 12]. Измерение активности АсАТ проводили в 0,05 М калий-фосфатном буфере, рН 7,5, содержавшем 0,75 мМ (для цито-плазматической АсАТ) и 1,5 мМ (для митохонд-риальной АсАТ) Ь-аспартат, 2,5 мМ (для цито-плазматической АсАТ) и 3,5 мМ (для митохонд-риальной АсАТ) 2-оксоглутарат, 0,1 мМ МЛОН, 1 Е/мл малатдегидрогеназы.
О скорости обратного трансаминирования под действием АсАТ судили по уменьшению оптической плотности в результате окисления МЛОРН в системе сопряженных ферментативных реакций, включающих в себя образование 2-оксоглутарата под действием АсАТ и его последующее превращение под действием изоцит-ратдегидрогеназы [13]. Измерение активности АсАТ проводили в 0,05 М калий-фосфатном буфере, рН 7,5, содержавшем 0,78 мМ (для цито-плазматической АсАТ) и 1 мМ (для митохондри-альной АсАТ) Ь-глутамат, 4,4 мМ (для цитоплаз-матической АсАТ) и 3,7 мМ (для митохондри-альной АсАТ) оксалоацетат, 0,4 мМ МЛБРН,
0,5 мМ MnCl2, 10 мМ NaHCO3, 1 Е/мл изоцит-ратдегидрогеназы.
За единицу активности (Е) принимали количество фермента, превращающее 1 мкмоль субстрата за 1 мин при 25°. Содержание белка определяли по методу Лоури [14] и с модификацией Юу и Стика [15] для проб, содержащих Triton Х-100.
Исследование субклеточной локализации ферментов проводили методом дифференциального центрифугирования [16]. Для этого навеску ткани печени крысы гомогенизировали в 4-кратном объеме среды выделения, приготовленной на основе 0,05 М Tris-HCl-буфера, рН 7,8, (для NADP-ИДГ) или 0,05 М калий-фосфатного буфера, рН 7,8 (для АсАТ). Среда выделения содержала 0,25 М сахарозу, 1 М ЭДТА, 1%-ный Р-меркаптоэтанол (для АсАТ), в среду для NADP-ИДГ добавляли дополнительно 0,5 мМ изоцитрат. Гомогенат фильтровали и центрифугировали при 5000 g в течение 10 мин для отделения неразрушенных клеточных элементов и мембран органелл. Надосадочную жидкость вновь центрифугировали при 18 000 g в течение 15 мин. Полученный супернатант, содержащий цитоплазматические ферменты, использовали для дальнейшей очистки. Осадок, содержащий в основном митохондрии, после отмывания ре-суспендировали в среде следующего состава: 0,05 М Tris-HCl-буфер, рН 7,8, 1 мМ ЭДТА, 20%-ный глицерин, 1%-ный Р-меркаптоэтанол, 0,5 мМ изоцитрат - для NADP-ИДГ; 0,05 М калий-фосфатный буфер, рН 7,8, 1 мМ ЭДТА, 20%-ный глицерин, 1%-ный Р-меркаптоэтанол — для АсАТ. Митохондрии разрушали под действием осмотического шока в гомогенизаторе Поттера, для более полной солюбилизации использовали Тгкоп Х-100 (0,1%-ный раствор). Полученный экстракт анализировали на присутствие ферментативной активности. Маркерными ферментами митохондрий и цитоплазмы служили сукцинатдегидрогеназа (СДГ) [17] и лактатдегидрогеназа (ЛДГ) [18] соответственно.
После разделения клеточных фракций методом дифференциального центрифугирования для дальнейшей очистки ферментов применяли следующие методы: фракционирование сульфатом аммония (для цитоплазматической NADP-ИДГ, 35—70% насыщения); освобождение от низкомолекулярных примесей с помощью гель-фильтрации через Сефадекс G-25; ионообменную хроматографию на ДЭАЭ-целлюлозе; гель-хроматографию на Сефадексе G-150. В качестве элюирующей среды при гель-фильтрации на колонке с Сефадексом G-25 (1,7 х 20 см) для NADP-ИДГ использовали 0,01 М Tris-HCl-буфер, рН 7,8, содержавший 1,5 мМ изоцитрат, 2 мМ
MnCl2, 0,1 мМ ЭДТА и 0,05 мМ ß-меркаптоэта-нол. Среда элюции для АсАТ имела следующий состав: 0,01 М калий-фосфатный буфер, рН 7,8, 1 мМ ЭДТА и 1%-ный ß-меркаптоэтанол. В ходе ионообменной хроматографии на ДЭАЭ-цел-люлозе белковую фракцию наносили на колонку (1,4 х 13 см), уравновешенную элюирующей средой такого же состава, что и в случае с Сефа-дексом G-25. Для очистки ферментов использовали ступенчатый градиент концентрации KCl в элюирующем буфере. Десорбцию NADP-ИДГ осуществляли в градиенте 40—70 мМ, АсАТ — 10—35 мМ. При гель-хроматографии на Сефа-дексе G-150 (2,2 х 65 см) элюцию осуществляли тем же буфером, что и при гель-фильтрации через Сефадекс G-25, со скоростью 30 мл/ч. Все перечисленные выше операции проводили при 0—4°.
Контроль гомогенности ферментов осуществляли электрофоретически по методу Дэвиса в 7,5%-ном ПААГ [19]. Гели окрашивали кумасси голубым R-250 [20]. Молекулярную массу определяли с помощью гель-хроматографии на Се-фадексе G-150 [21]. Определение констант ин-гибирования осуществляли по методу Диксона [22]. Статистическую обработку результатов проводили с применением стандартных статистических методов [23]. Для построения графиков использовали данные, обработанные с помощью программ линейной и параболической аппроксимаций.
В работе использовали следующие реактивы и материалы: Сефадекс G-25, G-150 («Pharmacia», Швеция), ДЭАЭ-целлюлоза DE-52 (Whatman», Великобритания), Tris («Serva», Германия), изо-цитрат, 2-оксоглутарат, оксал
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.