научная статья по теме РЕГУЛЯЦИЯ МИКРОБИЦИДНОЙ И СЕКРЕТОРНОЙ АКТИВНОСТИ ЭФФЕКТОРОВ ВРОЖДЕННОГО ИММУНИТЕТА МИЕЛОПЕПТИДАМИ Математика

Текст научной статьи на тему «РЕГУЛЯЦИЯ МИКРОБИЦИДНОЙ И СЕКРЕТОРНОЙ АКТИВНОСТИ ЭФФЕКТОРОВ ВРОЖДЕННОГО ИММУНИТЕТА МИЕЛОПЕПТИДАМИ»

ДОКЛАДЫ АКАДЕМИИ НАУК, 2011, том 436, № 1, с. 125-128

КЛЕТОЧНАЯ БИОЛОГИЯ

УДК 615.276.2/.4.015.44

РЕГУЛЯЦИЯ МИКРОБИЦИДНОЙ И СЕКРЕТОРНОЙ АКТИВНОСТИ ЭФФЕКТОРОВ ВРОЖДЕННОГО ИММУНИТЕТА МИЕЛОПЕПТИДАМИ

© 2011 г. Академик В. А. Черешнев, С. В. Гейн, Л. С. Мазунина, Т. В. Гаврилова, М. В. Черешнева

Поступило 28.07.2010 г.

Миелопептиды представляют собой группу биорегуляторных пептидов костномозгового происхождения, обладающих широким спектром биологической активности, отдельные пептидные фракции которых обладают способностью направленно влиять на различные звенья иммуногенеза [1]. В настоящее время из супернатантов культур клеток костного мозга выделено шесть отдельных миелопептидов (МП-1, МП-2, МП-3, МП-4, МП-5, МП-6), отличающихся друг от друга по направленности действия и точке приложения [2]. В настоящей работе нами исследованы функции МП-3 как основного модулятора функций клеток врожденного иммунитета, а также МП-5 и МП-6, дифференцировочных факторов, иммунорегуляторное действие которых в настоящее время изучено наименее полно.

Более древним в филогенетическом плане звеном иммунной системы является врожденный иммунитет, отвечающий за распознавание, уничтожение и удаление чужеродных агентов из организма. В реализации функций врожденного иммунитета принимают участие ряд клеточных популяций миелоидного (гранулоциты, моноциты-макрофаги, дендритные клетки) и лимфоид-ного (ЫК, ЫКТ, у8Т-клетки) происхождения. Помимо антимикробной функции клетки врожденного иммунитета активно участвуют в регуляции и индукции адаптивного ответа против опухолевых и микробных антигенов. Ранее нами было показано угнетающее влияние миелопептидов МП-1, МП-3, МП-5, МП-6 на ФГА-индуциро-ванный пролиферативный ответ лимфоцитов и ЛПС-индуцированную продукцию 1Ь-1р [3, 4]. Цель настоящей работы — исследовать влияние

Институт экологии и генетики микроорганизмов Уральского отделения Российской Академии наук, Пермь

Пермский государственный университет Институт иммунологии и физиологии Уральского отделения Российской Академии наук, Екатеринбург

Пермская государственная медицинская академия

миелопептидов МП-3, МП-5 и МП-6 на продукцию активных форм кислорода фракциями лейкоцитов и нейтрофилов, а также секрецию про-воспалительных факторов 1Ь-1р и ТЫР-а клетками цельной крови.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В качестве объекта для исследования продукции активных форм кислорода использовали нефрак-ционированные лейкоциты, а также фракцию ней-трофилов периферической крови здоровых доноров-добровольцев в возрасте от 20 до 22 лет. Нефракционированную лейкоцитарную взвесь получали путем отстаивания гепаринизирован-ной венозной крови в течение 2 ч при 37°С. Выделение нейтрофилов производили путем центрифугирования верхнего слоя плазмы с лейкоцитами на градиенте плотности фиколл—верографин р = 1.077. Супернатант с мононуклеарными клетками удаляли, а осадок, содержащий нейтрофи-лы, собирали и дважды отмывали от фиколла в среде ЯРМ1 1640. Чистота популяции нейтрофилов, выделенных таким способом, составила 95— 98%.

Оценку кислородзависимой микробицидной активности лейкоцитов осуществляли с использованием реакции люминолзависимой хемилю-минесценции (ЛЗХЛ). Реакцию проводили в 96-луночных плоскодонных планшетах ('^гетег", Германия), каждая лунка содержала 105 клеток в 100 мкл раствора Хенкса. В качестве индуктора ЛЗХЛ использовали опсонизированный зимозан в концентрации 150 мкг/мл. Маркёром выраженности реакции ЛХЗЛ служил люминол (10-5 М), свечение которого неизбирательно по отношению к различным кислородсодержащим радикалам [5]. Регистрацию результатов вели в течение 1 ч с помощью многофункционального спектрофотометра ТЕСАЫ (Австрия).

Продукцию провоспалительных цитокинов исследовали в культурах цельной крови [6]. Для этого 10 мкл цельной гепаринизированной крови культивировали в 96-луночных планшетах в полной питательной среде (ППС), приготовленной

Люминесценция, отн. ед.

140 120 100 80 60 40 20

0

400 350 300 250 200 150 100 50

0

Контроль МП-3 МП-5 МП-6

(а)

15

25 (б)

40

50

60

15

25

40

50

60 мин

Рис. 1. Влияние миелопептидов МП-3, МП-5, МП-6 на спонтанную (а) и зимозаниндуцированную (б) ЛЗХЛ лейкоцитов. Звездочка — p < 0.05 к контролю.

Люминесценция, отн. ед. 100

80 60 40 20

0

250 2001150

100 50

0

(а)

Контроль МП-3 МП-5 МП-6

15

15

25 (б)

40

50

60

25

40

50

60 мин

Рис. 2. Влияние миелопептидов МП-3, МП-5, МП-6 на спонтанную (а) и зимозаниндуцированную (б) ЛЗХЛ нейтрофилов. Звездочка — p < 0.05 к контролю.

на основе RPMI-1640 с добавлением 10 мМ HEPES ("Sigma"), 2 мМ Z-глутамина ("Sigma"), 100 мкг/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина и 10% эмбриональной телячьей сыворотки ("Биолот", Санкт-Петербург). Миелопептиды вносили в культуры в концентрациях МП-3 10-8 г/мл, МП-5 и МП-6 10-7 г/мл. В качестве индуктора синтеза цитокинов использовали опсонизирован-ный зимозан в концентрациях 150 и 1500 мкг/мл. Определение концентрации IL-1P и TNF-a в су-пернатантах культур проводили методом твердофазного иммуноферментного анализа с использованием наборов "Вектор-Бест" (Новосибирск). Статистическую обработку данных производили с использованием парного i-критерия Стьюдента.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Как видно из рис. 1, в лейкоцитарных культурах, стимулированных зимозаном, все исследуемые миелопептиды, начиная с 25-й мин реакции, проявили угнетающее действие на продукцию ак-

тивных форм кислорода. Эффектов миелопептидов на спонтанную ЛЗХЛ в лейкоцитарной взвеси не обнаружено. В пробах с очищенной фракцией нейтрофилов (рис. 2) выявлено угнетающее действие МП-3 на 25-й и 40-й минутах реакции. МП-5 и МП-6 подавляли стимулированную зимозаном ЛЗХЛ более выражено с 15-й по 60-ю минуту эксперимента. На спонтанную ЛЗХЛ нейтрофилов достоверных эффектов МП-3, МП-5 и МП-6 не выявлено.

В культурах клеток цельной крови все исследуемые миелопептиды оказали стимулирующий эффект на спонтанную продукцию 1Ь-1р (рис. 3). В стимулированных зимозаном культурах действие миелопептидов зависело от концентрации индуктора. Обращает на себя внимание тот факт, что пик продукции 1Ь-1р наблюдался в культурах с максимальной концентрацией зимозана, в то время как пик индукции ТМБ-а зарегистрирован в присутствии более низкой концентрации индуктора. При стимуляции культур зимозаном в концентрации

5

5

5

5

РЕГУЛЯЦИЯ МИКРОБИЦИДНОИ И СЕКРЕТОРНОЙ АКТИВНОСТИ

127

Продукция, пг/мл 600 Г Без индуктора 500 400 300 200 100

0

400 300 200 100 0

(а)

ЗМ 150 мкг/мл

* * _U_U_Li

ЗМ 1500 мкг/мл

-J— . * *

ь-

К МП-3 МП-5 МП-6

Без индуктора

К МП-3 МП-5МП-6 (б)

ЗМ 150 мкг/мл

* -i-

К МП-3 МП-5 МП-6 ЗМ 1500 мкг/мл

-i-1 r-i-1 r-i

К МП-3 МП-5 МП-6

К МП-3 МП-5 МП-6

К МП-3 МП-5 МП-6

Рис. 3. Влияние миелопептидов МП-3, МП-5, МП-6 на спонтанную и зимозаниндуцированную продукцию ГИР (а) и ТЫР-а (б) клетками цельной крови. Звездочка — р < 0.05 к контролю.

*

150 мкг/мл эффектов пептидов на секрецию IL-1P не было выявлено, однако в культурах с концентрацией зимозана 1500 мкг/мл все исследуемые пептиды угнетали продукцию IL-1p. Продукция TNF-a под влиянием миелопептидов снижалась в культурах с зимозаном 150 мкг/мл и не изменялась в нестимулирован-ных культурах, а также в присутствии зимозана 1500 мкг/мл.

Таким образом, миелопептиды МП-3, МП-5 и МП-6 в зависимости от степени активации клеток способны разнонаправленно регулировать продукцию активных форм кислорода нейтро-фильными гранулоцитами и секрецию провоспа-лительных цитокинов лейкоцитами периферической крови. Ранее нами была показана способность миелопептидов угнетать фагоцитарную активность нейтрофилов [7], ЛПС-индуцирован-ную продукцию IL-1P и ФГА-индуцированный пролиферативный ответ лимфоцитов in vitro [3, 4]. В то же время показано стимулирующее влияние МП-3 на фагоцитарную активность макрофагов [8], а также зарегистрировано усиление в присутствии МП-3 антигенпрезентирующей способности незрелых дендритных клеток, увеличение их способности индуцировать антигенспецифиче-ские цитотоксические лимфоциты. Помимо этого, МП-3 повышал устойчивость дендритных клеток к апоптозу, вызванному отсутствием цито-

кинов [9]. По результатам, полученным в ходе выполнения настоящей работы, можно сделать вывод об отсутствии либо слабом стимулирующем эффекте миелопептидов в отношении деактиви-рованных клеток иммунной системы. В то же время функции стимулированных клеток в присутствии миелопептидов снижаются и наиболее выражены на пике активационного воздействия. При сравнительном анализе эффектов различных миелопептидов обращает на себя внимание их однонаправленное влияние на исследуемые показатели, что предполагает наличие единого механизма действия у данной группы пептидных биорегуляторов.

Работа поддержана грантом РФФИ-Урал-а № 10—04—96021 и программой Президиума УрО РАН "Фундаментальные науки — медицине".

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Mikhailova A., Fonina L., Kirilina E. et al. // Regulatory Peptides. 1994. V. 53. P. 203-209.

2. Петров Р.В., Михайлова А.А., Фонина Л.А. и др. Миелопептиды. М.: Наука, 2000. 181 с.

3. Гаврилова Т.В., Гейн С.В., Погудина Т.А. и др. // Бюл. эксперим. биологии и медицины. 2005. Т. 140. № 7. С. 85-87.

4. Гейн С.В., Гаврилова Т.В., Черешнев В.А. и др. // Ци-токины и воспаление. 2008. Т. 7. № 1. С. 24-28.

5. Pecivova J., Macickova T., CizM. et al. // Physiol. Res. 2004. V. 53. P. 97-102.

6. LangezaalI., Coecke S, Hartung T. // Toxicol. in vitro. 2001. V. 15. № 4/5. Р. 313-318.

7. Гаврилова Т.В., Гейн С.В. Иммуномодулирующие эффекты миелопептидов при экспериментальном

проникающем ранении глаза. Екатеринбург, 2004. 101 с.

8. Априкян В.С., Михайлова А.А., Петров Р.В. // Иммунология. 2000. № 2. С. 21-23.

9. Хомякова А.В., Москалева Е.Ю., Фонина Л.А. и др. // Иммунология. 2007. № 5. С. 285-289.

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

Показать целиком