ПРИКЛАДНАЯ БИОХИМИЯ И МИКРОБИОЛОГИЯ, 2014, том 50, № 2, с. 197-202
УДК 577.1:632.938.1
РЕГУЛЯЦИЯ ПЕРОКСИДАЗНОЙ АКТИВНОСТИ ПОД ВЛИЯНИЕМ СИГНАЛЬНЫХ МОЛЕКУЛ и Bacillus subtilis 26Д В ИНФИЦИРОВАННЫХ Phytophthora infestans РАСТЕНИЯХ КАРТОФЕЛЯ
© 2014 г. И. В. Максимов*, Р. Р. Абизгильдина**, А. В. Сорокань*, Г. Ф. Бурханова*
*Институт биохимии и генетики Уфимского научного центра РАН, Уфа, 450054 **ООО "Научно-технический центр Салаватнефтеоргсинтез", Салават, 453256
e-mail: phyto@anrb.ru Поступила в редакцию 16.08.2013 г.
Изучено влияние последовательного воздействия 5 х 10-5 М салициловой (СК) или 1 х 10-7 М жас-моновой (ЖК) кислоты и штамма эндофитной бактерии Bacillus subtilis 26Д на активность перокси-дазы и транскрипцию гена изопероксидазы М21334 растений картофеля (Solanum tuberosum L.), а также формирование у них устойчивости к возбудителю фитофтороза Phytophthora infestans (Mont.) de Bary. Обнаружено, что если индивидуальное применение ЖК или Bacillus subtilis 26Д и последовательное воздействие СК и B. subtilis 26Д были наиболее эффективными в защите растений от патогена, то последовательное использование ЖК и B. subtilis 26Д резко подавляло их устойчивость. Полученные результаты указывают на необходимость строгого соблюдения регламента при использовании СК и ЖК, а также биопрепаратов на основе живых бактерий, в качестве современных средств защиты растений со свойствами иммуномодуляторов, запускающих определенные сигнальные пути, зачастую интерферирующие между собой.
DOI: 10.7868/S0555109914020135
В последние десятилетия в мире растет интерес к биологическим средствам защиты растений, которые, в отличие от химических средств, экологичны и безопасны при применении. К ним следует отнести соединения природного происхождения или химически синтезированные их аналоги, а также живые культуры микроорганизмов, способные стимулировать иммунный потенциал растений в отношении патогенов [1—5]. Устойчивость растений к патогенам обычно проявляется в виде системной индуцированной устойчивости или системной приобретенной устойчивости [3, 5—7], в которую в качестве посредников вовлечены жасмоновая (ЖК) и салициловая (СК) кислоты соответственно.
Исследованиями последних лет доказано, что многие организмы, в том числе и сельскохозяйственные культуры, содержат в своих тканях эн-дофитные микроорганизмы (бактерии, грибы) [8]. Их участие в регуляции роста растений, азот-фиксации, синтезе биологически активных соединений и в биоконтроле развития патогенов [9, 10] открывает большие перспективы для их использования в защите растений от стрессовых факторов окружающей среды, в том числе и биотических. Среди эндофитных микроорганизмов значительный интерес вызывают бактерии рода Bacillus, на основе которых создают препараты против патогенов [11]. Так, после идентификации и токсикологических исследований в Институте
микробиологии и вирусологии HAH Украины под руководством академика HAH Украины В.В. Смирнова из тканей растений хлопчатника был выделен штамм бактерии B. subtilis ВНИИСХМ 128 (26Д) [12], на основе которого, на базе предприятия "Башинком" (г. Уфа), налажено производство биопрепарата "Фитоспорин-М". Хотя этот биопрепарат рекомендован для использования на посевах различных сельскохозяйственных культур и активно используется в хозяйствах в качестве защитного средства, фундаментальные основы физиолого-биохимических механизмов формирования устойчивости растений к патогенам под влиянием его биологической основы остаются еще практически не исследованными.
Цель работы — определение влияния последовательного воздействия салициловой или жасмо-новой кислот и штамма эндофитной бактерии B. subtilis 26Д на активность пероксидазы в растениях картофеля, транскрипцию одного из генов, кодирующих пероксидазу М21334, и формирование у них устойчивости к возбудителю фитофтороза P. infestans.
МЕТОДИКА
Растительный и микробный материал. В работе были использованы пробирочные стерильные растения картофеля (Solanum tuberosum L.) восприимчивого к фитофторозу сорта Ранняя роза,
198 MAKCИMOВ и др.
Подбор праймеров для гена пероксидазы картофеля М21334
Ген Нуклеотидная последовательность праймеров Размер ожидаемого ампликона ^ЬИка
М21334 FS'-GTAATCCTGCCGCACAACT-3' ÄS'-GCAGCAAAATCTCCAAGGAA-3' 282 п.н. [17]
Aктин X55749.1 FS'-GATGGTGTCAGCCACAC-3' RS'-ATTCCAGCAGCTTCCATTCC-3' 320 п.н. Gen Bank
культивируемые в течение 30 сут при 16-часовой освещенности 12—16 тыс. люкс (лампы Osram L 36W/77, Германия), в климатокамере КС-200 ("Смоленский СКТБ СПУ", Россия) на агаризо-ванной среде МС с добавлением 5 х 10-5 М СК и 1 х 10-7 М ЖК. Биологически эффективные концентрации были подобраны согласно работам группы О.Л. Озерецковской [13]. Для экспериментов оригинальный штамм бактерии B. subtilis 26Д был выделен из коммерческого препарата Фитоспорин-М. Конечная концентрация бактериальной суспензии — 108 кл./мл. Инокуляцию растений проводили путем нанесения 5 мкл суспензии на зону, ближайшую к зоне формирования придаточных корней 7-суточных пробирочных растений, которые культивировали на соответствующих средах.
Культура оомицета Phytophthora infestans (Mont.) de Bary (штамм 1.2) была любезно предоставлена Ю.Т. Дьяковым из Коллекции биологического факультета Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова. Перед началом опыта производилось восстановление его агрессивности путем реинокуляции через стерильные микроклубни, полученные в пробирочной культуре. На 2 сут после инокуляции пораженная ткань пересаживалась на среду Чапека и выращивалась в течение 7 сут. Для получения зооспор мицелиальную культуру P. infestans в чашке Петри заливали 10 мл стерильной дистиллированной водой и выдерживали 1 ч при комнатной температуре. Зооспоры подсчитывали в камере Фукса-Розенталя.
Часть пробирочных растений картофеля после 30 сут культивирования на питательной среде МС инфицировали нанесением суспензии зооспор (105 спор/мл) по 5 мкл на лист. Через 24, 48 и 72 ч растения фиксировали для биохимических анализов. Визуальные симптомы болезни наблюдали в течение 7 сут и степень их развития оценивали по суммарной площади некроза на листьях.
Для выделения пероксидазы растительный материал промывали и подсушивали на фильтровальной бумаге, взвешивали и растирали в фарфоровой ступке с добавлением 0.05 М Na-фосфатно-го буфера (ФБ), рН 6.2, в соотношении 1 : 5 (1 часть растительного материала и 5 частей ФБ), экстраги-
ровали в течение 30 мин при 4°С и супернатант отделяли от растительных остатков при 15000 g на центрифуге 5415К ("Eppendorf", США).
Для определения пероксидазной активности супернатант разбавляли в 30—50 раз в ФБ (рН 6.2) и раскапывали в лунки плоскодонных планшетов для иммуноанализа ("Nunc", США) в следующем порядке: 75 мкл образца, 25 мкл 0.08%-ного о-фе-нилендиамина, 25 мкл 0.016%-ной Н2О2. Ферментативную реакцию останавливали 50 мкл 4 н. серной кислоты. Оптическую плотность при 490 нм измеряли на приборе для иммунофер-ментного анализа Benchmark Microplate Reader ("Bio-Rad", США).
Ранее было показано, что пероксидазы — эффективные маркерные белки, на основе накопления которых можно судить о механизмах развития защитной системы растений против патогенов [14]. К гену пероксидазы картофеля М21334 нами подобраны праймеры (таблица), которые были использованы для анализа активности его транскрипции в растениях в условиях воздействия на них бактерии B. subtilis 26Д и сигнальных молекул.
Выделение общей РНК. Выделение проводили с использованием тризола ("Molecular Research Center, Inc", США), согласно протоколу фирмы -поставщика, из побегов картофеля, зафиксированных в жидком азоте, через 6, 24 и 48 ч после инокуляции. Реакцию обратной транскрипции (от-ПЦР) проводили в 20 мкл общего объема смеси, содержащей 10 мкг общей РНК, 1.0 мкл M-MuLV обратной транскриптазы ("Fermentas", Литва), 9 мкл буфера для обратной транскрипции, 32 мМ MgCl2, 1.0 мкл олигонуклеотидных праймеров, по 5 мкл 1.25 мМ d NTP. Отжиг прай-меров на матрице РНК проводили в течение 5 мин при 65°С, а построение кДНК — по матрице РНК в течение 1 ч при 37°С. Полученную кДНК использовали в реакции амплификации. Концентрации РНК всех образцов выравнивались посредством измерения ее оптической плотности в образцах на спектрофотометре BioSpec-mini DNA-RNA-Protein analyzer ("Shimadzu", Япония). ПЦР проводили в амплификаторе типа ТП4-ПЦР-01-"Терцик" ("ДНК-Технология", Россия).
Электрофоретическое разделения ПЦР-про-дуктов. Разделение проводили в 7%-ном ПААГ в
мм 25
20 15 10
5 -
1 2 3 4 5
Время после инфицирования, сут
Рис. 1. Изменения в динамике развития симптомов фитофтороза (размер некротического пятна, мм2) на растениях картофеля под влиянием индукторов устойчивости и бактериальной культуры B. subtilis 26Д: 1 - контроль (вода); 2 - СК; 3 - ЖК; 4 - B. subtilis; 5 — B. subtilis + СК; 6 - B. subtilis + ЖК.
электрофоретической камере Mini-Protean II Electrophoretic Ct-II ("Bio-Rad", США). Для визуализации ДНК после электрофореза гель в течение 10 мин инкубировали в растворе бромистого этидия (0.5 мкг/мл) и просматривали в трансиллюминаторе GelDoc XR ("Bio-Rad", США), фотодокументировали на системе Gel Camera System, полученные данные обрабатывали с помощью прилагающейся компьютерной программы Lab Works 4.6 и Total Lab v2.01 ("UVP, Inc.", США). Для определения размеров ампликонов использовали маркерные ДНК Gene Ruler TM 100 bp DNA Ladder ("Fermentas", Литва). Данные по активности транскрипции гена пероксидазы картофеля М21334 нормализованы против активности транскрипции гена актина.
Все опыты проводились в 3 биологических и 3 аналитических повторностях. Статистическая обработка результатов производилась с использованием компьютерных программ фирмы StatSoft (Statistica 6.0). Количественные данные обрабатывались статистически, приведены средние значения биологических повторов ± стандартное отклонение.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
На контрольных растениях фитофтороз активно развивался. Сигнальные молекулы и бактериальная культура В. зыЬИШ 26Д снижали интенсивность проявления симптомов (рис. 1)
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.