БИОХИМИЯ, 2006, том 71, вып. 10, с. 1392 - 1398
УДК 511.1
РЕГУЛЯЦИЯ ПЕРОКСИДАЗНОЙ АКТИВНОСТИ ЦИТОХРОМА с С ПОМОЩЬЮ ОКСИДА АЗОТА И ЛАЗЕРНОГО ИЗЛУЧЕНИЯ*
© 2006 г. А.Н. Осипов1**, Г.О. Степанов1, Ю.А. Владимиров2, А.В. Козлов3, В.Е. Каган4
1 Российский государственный медицинский университет, 117513 Москва, ул. Островитянова 1; факс: (495)434-1174, электронная почта: anosipov@yahoo.com 2 Факультет фундаментальной медицины Московского государственного университета им. М. В. Ломоносова, 117192 Москва, Ломоносовский пр., 31/5, электронная почта: yuvlad@mail.ru
3 Ludwig Boltzmann Institute for Experimental and Clinical Traumatology, Donaueschingenstrasse 13, A-1200 Vienna, Austria; E-mail: andrey.kozlov@vu-wien.ac.at
4 University of Pittsburgh, 100 Technology Dr., Suite 333, 15260 Pittsburgh, PA, USA; E-mail: vkagan@ceoh.pitt.edu
Поступила в редакцию 19.04.06 После доработки 26.05.06
Апоптоз, вызванный как активацией «рецепторов смерти», так и внутриклеточными апоптогенными факторами, как правило, развивается через стадию выхода цитохрома с из митохондрий, которая знаменует переход процесса в необратимую фазу. Одним из важнейших событий при развитии апоптоза служит появление у цитохрома с пероксидазной активности при его взаимодействии с кардиолипином. В настоящей работе исследовано изменение пероксидазной активности цитохрома с в комплексе с кардиолипином, несущим отрицательный заряд, и анионным детергентом Ds-Na и возможность ингибирования этой активности оксидом азота. Используя метод люминолзависимой хемилюминесценции нами обнаружено, что перок-сидазная активность цитохрома с, увеличенная в несколько раз, благодаря присутствию кардиолипина или Ds-Na, существенно снижается в присутствии оксида азота. Более того, нитрозильные комплексы цитохрома с оказались чувствительными к действию излучения He-Cd лазера (441 нм) и распадались в процессе облучения. Распад этих комплексов приводил к частичному восстановлению пероксидазной активности. Таким образом, оксид азота и лазерное излучение могут быть использованы как инструменты для регуляции пероксидазной активности цитохрома с, и возможно, процесса апоптоза.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: апоптоз, цитохром с, кардиолипин, оксид азота, лазерное излучение, пероксидазная активность.
Процесс запрограммированной клеточной смерти (апоптоз), является одним из важнейших и интереснейших механизмов, определяющих развитие и судьбу клеток, тканей и, в конечном итоге, всего организма. Различают два типа апоптоза, отличающихся по своей начальной стадии — апоптоз, зависящий от «рецепторов смерти», и апоптоз, вызываемый специфическими проапоптотическими стимулами [1—4]. Активация рецепторов или воздействие стимулов приводит в конечном итоге к активации се-риновых протеиназ (каспаз) и завершается ги-
* Первоначально английский вариант рукописи был опубликован на сайте «Biochemistry» (Moscow), Papers in Press, BM 06-112, 17.09.2006.
** Адресат для корреспонденции и запросов оттисков.
белью клетки [1, 2, 5—8]. Центральную роль в развитии апоптоза играют митохондрии, выход цитохрома с из которых считается этапом перехода апоптоза в необратимую стадию [1, 3, 9]. Отмечено, что выходу цитохрома с из митохондрий предшествует появление у него высокой пе-роксидазной активности, которое происходит в результате взаимодействия цитохрома с с отрицательно заряженными фосфолипидами, такими как кардиолипин, фосфатидилсерин, а также Ds-Na [10, 11]. Предполагается, что именно пе-роксидазное окисление липидов мембран и белков цитохромом с и приводит к повреждению АТФ-АДФ-антипортера (ААА), что способствует образованию мембранной поры, набуханию матрикса и разрыву мембран митохондрий, в результате чего цитохром с выходит в цитоплазму.
Пероксидазное окисление липидов мембран цитохромом с может способствовать также появлению мегапор в наружной мембране митохондрий, через которые может выходить в цитоплазму цитохром с [10, 11].
Хорошо известно, что оксид азота может легко взаимодействовать с гемопротеинами, и образовывать нитрозильные комплексы [12]. Формирование подобных комплексов в большинстве случаев (за исключением гуанилатциклазы) ин-гибирует функции гемопротеинов. Недавно нами было показано, что комплексы цитохрома с с кардиолипином могут легко образовывать нитрозильные комплексы в реакции с оксидом азота, что приводит к снижению его пероксидазной активности [13]. В настоящей работе, нами показано, что образовавшиеся при взаимодействии цитохрома с с оксидом азота в присутствии кар-диолипина или Ds-Na, нитрозильные комплексы обладают фоточувствительностью и могут распадаться под действием излучения He-Cd лазера (с длиной волны 441 нм) [14]. Фотолиз нит-розильных комплексов цитохрома с приводит к восстановлению его пероксидазной активности.
МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Реактивы. В работе использовали цитохром с из сердца лошади («Sigma»,США); тетраолеоил кардиолипин и пальмитоил стеароил фосфати-дилхолин («Avanti Polar Lipids», США); Ds-Na («Sigma»), а также насыщенный раствор оксида азота в фосфатном буфере, полученный продуванием газообразного NO через фосфатный буфер.
Приготовление липосом. Для приготовления липосом кардиолипин и фосфатидилхолин брали в эквимолярных количествах, при этом сначала навеска каждого липида отдельно растворялась в хлороформе и лишь после этого они смешивались, после чего хлороформ удаляли, продувая смесь липидов аргоном. Затем добавляли 10 мМ фосфатный буфер (pH 7,4), и интенсивно перемешивали до полного образования грубой суспензии, после чего суспензию обрабатывали ультразвуком в ультразвуковой ванне до образования полупрозрачного опалесцирующе-го раствора липосом. Суммарная концентрация липидов составляла 10 мМ.
Приготовление насыщенного раствора оксида азота. Для приготовления насыщенного раствора оксида азота 100 мл 10 мМ фосфатного буфера (pH 7,4) продували аргоном в течение 15 мин, а далее — оксидом азота, также в течение 15 мин до получения насыщенного раствора. Концентрация насыщенного раствора NO в буфере составляла примерно 2 мМ.
Люминолзависимая хемилюминесценция. Для
измерения свечения, возникающего в перокси-дазной реакции с участием цитохрома с, использовали хемилюминометры LKB 1251 (Швеция) и ХЛМ-3 («Бикап», Россия). В качестве субстрата пероксидазной реакции кроме 0,1 мМ перекиси водорода использовали (0,5 мМ) раствор люминола. Все эксперименты проводили при непрерывном перемешивании образца и постоянной температуре 22°.
Измерение концентрации оксида азота. Для измерения концентрации оксида азота использовали NO-чувствительный электрод компании «World Precision Instruments» (США). Измерения проводили в специализированной изолированной камере, содержащей изучаемый образец, из которого продуванием аргона был удален кислород.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Как было показано в работах [10, 15] цитохром с сам по себе обладает весьма низкой перок-сидазной активностью, однако в присутствии кардиолипина или Ds-Na она заметно увеличивается. Используя метод люминолзависимой хе-милюминесценции, мы исследовали перокси-дазную активность цитохрома с. В основе используемого метода лежит реакция окисления люминола цитохромом с, который, приобретая пе-роксидазную активность, окисляет люминол, что приводит к высвечиванию кванта света (рис. 1). На рис. 1 приведены результаты экспериментов, в которых мы измеряли люминолзависимую хе-милюминесценцию цитохрома с в присутствии кардиолипина (кардиолипин-фосфатидилхоли-новых липосом, кардиолипин: фосфатидилхолин 1 : 1) и Ds-Na. Можно видеть, что присутствие кардиолипина, или Ds-Na вместе с цитохромом с, способствует увеличению интенсивности хемилюминесценции, что является следствием увеличения пероксидазной активности цитохрома с. При одинаковом содержании кардиолипина или Ds-Na увеличение пероксидазной активности в присутствии кардиолипина было в несколько раз больше, чем в присутствии Ds-Na (кривые 2 и 3 на рис. 1).
Представляло интерес выяснить, как влияет соотношение цитохрома с и кардиолипина на пероксидазную активность цитохрома с. Сопоставляя заряды цитохрома с (+8) и кардиолипина (—2), можно было ожидать, что при соотношении цитохром : липид равном 1 : 4 произойдет нейтрализация зарядов комплекса, а следовательно, изменения в структуре молекулы цитохрома с, которые, могут влиять на его перокси-
Время, мин
Рис. 1. Изменение пероксидазной активности цитохрома с в присутствии кардиолипина или Образец содер-
жал: 1 — цитохром с (10 мкМ), 2 — цитохром с (10 мкМ) + (500 мкМ), 3 — цитохром с (10 мкМ) + кардиоли-пин-фосфатидилхолиновые липосомы (500 мкМ). Все растворы были приготовлены в 10 мМ фосфатном буфере (рН 7,4). Непосредственно перед исследованием в образец добавляли Н202 (100 мкМ) и люминол (500 мкМ)
дазную активность. На рис. 2 представлены результаты этих экспериментов. Видно, что в интервале соотношений от 1 : 1 до 1 : 4 пероксидаз-ная активность системы цитохром с : кардиоли-пин изменяется незначительно. При увеличении этого соотношения до 1 : 5 и далее до 1 : 10 происходит резкое увеличение пероксидазной активности цитохрома с. Дальнейшее увеличение этого соотношения не приводит к увеличению пероксидазной активности.
На рис. 2 также приведена зависимость интенсивности хемилюминесценции цитохрома с в присутствии от соотношения : ци-
тохром с. Можно видеть, что в отсутствие и в интервале соотношений : цитохром с
от 1 : 1 до 200 : 1, цитохром с не проявляет выраженной пероксидазной активности. Однако, при более высоких соотношениях уровень хеми-люминесценции, и соответствующая ему перок-сидазная активность, начинают быстро возрастать и при соотношении 500 : 1 интенсивность свечения становится почти в 35 раз выше, чем в отсутствие Дальнейшее увеличение ко-
личества молекул липида не приводило к изменению интенсивности хемилюминесценции ци-тохрома с.
Можно видеть, что в присутствии кардиолипина или происходят изменения перок-сидазной активности цитохрома с, которые в соответствии с результатами работ, связаны с изменением пространственной структуры активного центра. В результате этой перестройки
атом железа становится
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.