УДК 577.352.4
РЕГУЛЯЦИЯ ПОТЕНЦИАЛ-ЗАВИСИМЫХ Са2+-ТОКОВ L-ТИПА АГМАТИНОМ. ИМИДАЗОЛИНОВЫЕ РЕЦЕПТОРЫ В ИЗОЛИРОВАННЫХ КАРДИОМИОЦИТАХ © 2012 г. А. В. Мальцев, Э. В. Евдокимовский, О. Ю. Пименов, М. Н. Ненов, Ю. М. Кокоз
Институт теоретической и экспериментальной биофизики РАН, 142290, Пущино, Московская область, ул. Институтская, 3; электронная почта:goicr@rambler.ru Поступила в редакцию 23.01.2012 г.
Цель настоящей работы — исследование механизмов регуляции потенциал-зависимого Са2+-тока L-типа агматином в изолированных кардиомиоцитах и решение вопроса о возможном участии аг-матина в реализации "аргининового парадокса". Показано, что в изолированных кардиомиоцитах агматин дозо-зависимо в концентрациях от 200 мкМ до 15 мМ уменьшает амплитуду Са2+-тока L-типа. Селективные антагонисты а2-адренорецепторов (a2-ARs) иохимбин и раувольсцин не влияют на эффект агматина, в то время как смешанные антагонисты a2-ARs и имидазолиновых рецепторов первого типа (IiRs) эфароксан и идазоксан почти вдвое понижают эффективность агматина. Ингибитор NO-синтазы 7NI не влияет на снижение амплитуды Са2+-тока агматином, в то же время ингибитор протеинкиназы С кальфостин С резко уменьшает эффект агматина. Аргинин на фоне агматина и агматин на фоне аргинина не влияли на амплитуду Са2+-тока. Эти данные позволяют предполагать, что агматин не принимает участие в реализации "аргининового парадокса" и его эффект связан не с активацией эндотелиальной NO-синтазы ^NOS) и cGMP-зависимым подавлением тока, а с активацией I1Rs и сопряженного с этим рецептором сигнального пути, включающего протеинкиназу С. Ранее не было известно о возможной локализации IiRs в изолированных кардиомиоцитах; мы показали, что в этом типе клеток экспрессируются гены nischarin, гомологичные гену IRAS, который в современной литературе рассматривается в качестве основного кандидата на роль гена I1R.
Ключевые слова: Са2+-ток, агматин, имидазолиновые рецепторы.
Агматин — сигнальная молекула, которая образуется при декарбоксилировании Z-аргинина ферментом аргининдекарбоксилазой и является лигандом а2-адренорецепторов (a2-ARs) [1] и имидазолиновых рецепторов (IRs) [2, 3]. Агматин обладает широким спектром действия на сердечно-сосудистую систему человека и животных. Агматин дозо-зависимым образом снижает артериальное давление [4, 5] и может оказывать кардио-протекторное действие в модели ишемии— реперфузии [6]. На тканевом и клеточном уровне агматин подавляет пролиферацию гладких мышц сосудов [7] и оказывает негативное хронотропное действие, снижая частоту сердечных сокращений и амплитуду потенциала действия в пейсмекер-ных клетках сино-атриального узла [8]. Важным фактором, определяющим влияние агматина на внутриклеточные процессы, является его взаимодействие с группой специфических монооксиге-наз NO-синтаз (NOS), которые, используя как субстрат Z-аргинин, продуцируют один из основных внутриклеточных мессенджеров — оксид азота. Данные по влиянию агматина на активность NO-синтаз противоречивы: с одной стороны,
in vitro он ингибирует NOS в гомогенатах мозга и легочной артерии [9, 10], с другой — увеличивает активность NOS в эндотелиальных клетках [11] и изолированной почке [12]. Различия в результатах могут объясняться разными уровнями регуляции: в случае in vitro речь идет о прямом взаимодействии агматина и NOS, в случае экспериментов in situ на клетках и изолированных органах в наблюдаемые эффекты вносят вклад механизмы, активированные рецепторами.
Для объяснения механизма реализации "аргининового парадокса" Joshi и соавторы предположили, что в эндотелиальных клетках активация eNOS при добавлении экзогенного Z-аргинина обусловлена агматином, синтезированным из добавленного Z-аргинина аргининдекарбоксилазой, и последующей активацией вторичной мессен-джерной цепочки реакций, связанной с a2-ARs и фосфолипазой С [11]. Термин "аргининовый парадокс" возник в связи с тем, что константа Ми-хаэлиса для аргинина у всех известных изоформ NOS лежит в пределах от 2 до 10 мкМ при том, что концентрация Z-аргинина в плазме крови может достигать 400 мкМ, а эндотелиальные клетки на-
капливают его до 2 мМ. Поэтому можно сделать вывод, что организм млекопитающих содержит достаточное количество L-аргинина для поддержания максимального уровня активности NOS. Однако на уровне целого организма и в эндотели-альных клетках экзогенно добавленный L-арги-нин способен модулировать активность eNOS [11]. Нами показано, что при концентрации L-ар-гинина 1 мМ (что соответствует средней внутриклеточной концентрации) в среде выделения или инкубации изолированных кардиомиоцитов дополнительное введение 5 мМ L-аргинина приводит к увеличению активности eNOS и уменьшению амплитуды Са2+-тока L-типа [13, 14]. Эффект экзогенного L-аргинина в кардиомиоцитах обусловлен активацией а2-адренорецепторов и активацией сопряженного с ними сигнального пути, включающего последовательно фосфатиди-линозитол-3 киназу (PI3K), Akt-киназу, eNOS и cGMP-зависимое подавление Са2+-тока. Известно, что агматин может участвовать в регуляции потенциал-зависимых Са2+-токов в кардиомиоцитах [15]. Однако не доказано, что в кардиомиоцитах подавление Са2+-тока агматином связано c влиянием на eNOS, что означало бы, что агматин участвует в реализации "аргининового парадокса". Не показано также, с каким из типов рецепторов — a2-ARs или IRs — связан эффект агматина.
Цель настоящей работы — определение механизмов регуляции потенциал-зависимого Са2+-тока L-типа агматином в изолированных кардиомиоцитах и решение вопроса о возможном участии агматина в реализации "аргининового парадокса".
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Выделение клеток. Изолированные кардио-миоциты получали из сердец крыс Sprague Dawley и Wistar методом, описанным ранее [16]. Вес животных 200—250 г. Базовый раствор содержал (в мМ, pH 7.25): 80 NaCl, 10 KCl, 1.2 KH2PO4, 5 MgSO4, 20 глюкозы, 50 тaурина, 10 HEPES, 1 L-аргинина. Выделенное сердце перфузировали по Лангендорфу. Растворы подавали через буферную емкость (10 мл) в непрерывном режиме. Для отмыва препарата от крови (3—5 мин) использовали среду DMEM + 10 мМ HEPES, рН 7.25. После стабилизации сердечных сокращений перфузию проводили базовым раствором c Ca2+-EGTA буфером (pCa = 7) до остановки сердца (около одной минуты). Затем перфузию продолжали раствором следующего состава: на 100 мл базового раствора добавляли 20 мг проназы E, 100 мг бычьего сывороточного альбумина (5 фракция), 140 мкМ СаС12. Через 3—4 мин раствор, стекающий с препарата, приобретал вид вязких капель, после исчезновения которых перфузия прекращалась (общее время перфузии раствором с про-
назой не превышало 10 мин). Сердце снимали с канюли, помещали в базовый раствор с добавлением 200 мкМ CaCl2 и измельчали на небольшие фрагменты объемом 6—10 мм3. Диспергирование ткани на индивидуальные клетки, как и всю процедуру выделения клеток, проводили при температуре 37°С в том же растворе с проназой при скорости вращения мешалки 1—2 об/с. Для разделения ткани на индивидуальные клетки в начале процесса диспергирования добавляли 2—3 мг коллагеназы (тип IV) на 10 мл раствора с проназой. Через 20 мин брали первый слив. Раствор с полученными клетками очищали от недисперги-рованной ткани и агрегатов пропусканием через нейлоновую сетку. Оставшуюся ткань вновь диспергировали на мешалке в растворе с проназой и коллагеназой. Разделение, как правило, заканчивалось за 2—4 цикла. Клетки хранили при комнатной температуре в базовом растворе, содержащем 200 мкМ Ca2+.
Регистрация Са2+-токов L-типа. Экспериментальная камера содержала раствор следующего состава (в мМ): 80 NaCl; 2 CaCl2; 5 MgSO4; 1.2 KH2PO4; 10 CsCl; 20 TEA-Cl; 20 глюкозы; 10 HEPES, 1 Z-аргинина, pH 7.25. Раствор для заполнения стеклянных электродов содержал (в мМ): 130 CsCl; 5 MgSO4; 10 HEPES, pH 7.25. К+-токи блокировали добавлением TEA-Cl и заменой ионов калия ионами цезия (Cs+). Регистрацию Ca2+-токов L-типа проводили через 2—3 ч после выделения кардиомиоцитов методом whole-cell patch-clamp в конфигурации perforated patch при температуре 20—22°С. Для перфорации мембран использовали амфотерицин В. Электроды изготавливались из мягкого молибденового стекла и имели сопротивление 1—5 МОм. Поддерживаемый потенциал составлял —40 мВ, стимуляцию производили импульсами до 40 мВ длительностью 300 мс.
Выделение РНК. Для выделения тотальной РНК использовали суспензию изолированных кардиомиоцитов левого желудочка. К осадку кар-диомиоцитов добавляли 10 объемов лизирующего буфера, содержащего 4 М гуанидина тиоцианата, 25 мМ натрия цитрата, 0.5% лауроилсаркозила и 0.1 М p-меркаптоэтанола, смесь тщательно перемешивали. К лизату добавляли 1/10 объема 2 M AcONa, pH 5.0, 1 часть водонасыщенного (кислого) фенола, 1/5 объема смеси хлороформ-изоамило-вый спирт 24 : 1. После перемешивания инкубировали в течение 15 мин при 4°С. Пробирки центрифугировали при ускорении 2000 g. Водную фазу после центрифугирования переносили в новую пробирку, добавляли 2.5 объема 96% этилового спирта и оставляли на ночь при -20°С. На следующий день пробирки центрифугировали при ускорении 12000 g в течение 5 мин. Осадок РНК промывали 70% этанолом. РНК сушили на возду-
Рис. 1. Действие агматина на Са2+-токи Ь-типа в изолированных кардиомиоцитах.
а — Типичный эксперимент при действии 2 мМ агматина. Во всех экспериментах здесь и далее: Са2+-токи измерялись при поддерживаемом потенциале —40 мВ, амплитуде тестового стимула до 40 мВ и длительности стимула 300 мс. б — Дозо-зависимый эффект агматина на Са2+-токи Ь-типа (для каждой концентрации п > 3).
хе и растворяли в 20 мкл воды, обработанной ди-этилпирокарбонатом (DEPC).
Синтез первой цепи кДНК. Синтез первой цепи кДНК осуществляли с использованием набора реактивов MMLV Reverse Transcriptase kit (Евро-ген, Россия) по следующей процедуре: раствор, содержащий 14 мкл мРНК и 4 мкл oligo-d(T)18 праймера, инкубировали в течение 2 мин при 70°С, после охлаждения при 4°С к нему добавляли 8 мкл 5х буфера, 4 мкл смеси dNTP (10 мМ каждого), 4 мкл DTT (20 мМ), 4 мкл стерильной воды, 2 мкл MMLV ревертазы (200 ед.). Общий объем реакционной смес
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.