научная статья по теме РЕКОМБИНАНТНОЕ ПОЛНОРАЗМЕРНОЕ АНТИТЕЛО ЧЕЛОВЕКА ПРОТИВ ВИРУСА ЭБОЛА Химия

Текст научной статьи на тему «РЕКОМБИНАНТНОЕ ПОЛНОРАЗМЕРНОЕ АНТИТЕЛО ЧЕЛОВЕКА ПРОТИВ ВИРУСА ЭБОЛА»

БИООРГАНИЧЕСКАЯ ХИМИЯ, 2007, том 33, № 6, с. 598-605

УДК 578.821.5:577.01

РЕКОМБИНАНТНОЕ ПОЛНОРАЗМЕРНОЕ АНТИТЕЛО ЧЕЛОВЕКА

ПРОТИВ ВИРУСА ЭБОЛА

© 2007 г. Л. Н. Шингарова*#, Н. В. Тикунова**, Т. Э. Юн**, А. А. Чепурнов**, Т. К. Алиев*, Т. А. Батанова**, Е. Ф. Болдырева*, О. В. Некрасова*, В. А. Топорова*, А. А. Панина*,

М. П. Кирпичников*, |Л. С. Сандахчиев**

*Институт биоорганической химии им. акад. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, 117997 ГСП, Москва, В-437, ул. Миклухо-Маклая, 16/10; **ФГУНГосударственный научный центр вирусологии и биотехнологии "Вектор",

Новосибирская обл., пос. Колъцово Поступила в редакцию 31.08.2006 г. Принята к печати 06.10.2006 г.

Для конструирования полноразмерного антитела человека против вируса Эбола гены, кодирующие константные домены тяжелой и легкой цепей иммуноглобулина человека, были объединены с соответствующими фрагментами ДНК, кодирующими вариабельные домены одноцепочечного антитела 4D1, специфичного к вирусу Эбола, отобранного из комбинаторной фаговой библиотеки одно-цепочечных антител человека. Были созданы две экспрессионные плазмиды pCH1 и pCL1, содержащие искусственные гены, кодирующие тяжелую и легкую цепи иммуноглобулина человека соответственно. Их котрансфекция в клеточную линию эмбриональных почек человека HEK293T обеспечила продукцию полноразмерного рекомбинантного антитела человека. Константа аффинности этого антитела, измеренная с помощью твердофазного ИФА, составила 7.7 х 107 ± 1.5 х 107 М-1. Полученное антитело, как и исходное одноцепочечное антитело 4D1, связывало нуклеопротеин № вируса Эбола, но не взаимодействовало с белками вируса Марбург.

Ключевые слова: полноразмерные человеческие антитела; фаговый дисплей; вирус Эбола.

ВВЕДЕНИЕ

Рекомбинантные антитела могут играть важную роль в лечении инфекционных и аутоиммунных заболеваний. По литературным данным в настоящее время такие препараты на стадии прохождения клинических испытаний находятся на втором месте после вакцин. В основном производятся химерные (мышь-человек) [1, 2] и гуманизированные антитела [3], однако использование таких антител может приводить к возникновению нежелательного иммунного ответа на "мышиную" часть молекулы. Более перспективным, с точки зрения терапии, представляется получение полностью человеческих полноразмерных антител. Одним из подходов к созданию таких препаратов может быть конструирование полноразмерных человеческих антител на основе мини-антител человека, полученных из комбинаторных фаговых библиотек, в частности, библиотек одноцепочечных антител. Впервые одноцепочечные последовательности, составленные из вариабельных доменов легкой и

Сокращения: AT-VE - полноразмерное антитело человека против вируса Эбола; IgG - иммуноглобулины класса G; scFv - одноцепочечные антитела; МкАТ - моноклональ-ные антитела.

# Автор для связи (тел.: (495) 330-69-83; эл. почта: lshing@ mail. ibch. ru).

тяжелой цепей антител, объединенных гибким пептидным линкером, были получены Бёрдом и сотр. [4]. В дальнейшем были сконструированы фаговые библиотеки, в которых комбинации вариабельных доменов легких и тяжелых цепей антител продуцируются в составе оболочечного фагового белка в виде одноцепочечных антител, экспонированных на поверхности бактериофага [5-7]. Фрагменты ДНК из таких библиотек, кодирующие одноцепочечные антитела человека, могут служить источником антигенсвязывающих вариабельных фрагментов для получения полноразмерных человеческих антител генно-инженерными методами путем их объединения с участками ДНК, кодирующими константные области иммуноглобулина класса G человека. Есть сведения о получении рекомбинантных полноразмерных человеческих антител на основе вариабельных фрагментов из фаговых библиотек [8, 9], в том числе и антител против вирусных патогенов, однако в России такие работы ранее не проводились.

Вирус Эбола, представитель семейства Filovir-idae, является одним из самых патогенных среди известных человечеству вирусов. Сочетание высокой контагиозности, летальности, отсутствие средств профилактики и лечения однозначно относят его к четвертой - самой опасной группе па-

тогенных вирусов по классификации Всемирной организации здравоохранения. Причины патофизиологических изменений, которые делают лихорадку Эбола такой опасной, до сих пор непонятны, неизвестен природный резервуар этого вируса. Механизмы, обеспечивающие выздоровление индивидуумов после болезни, вызываемой вирусом Эбола, изучены плохо [10]. В настоящее время отсутствуют действенные средства борьбы с филовирусными инфекциями: вакцины находятся в стадии разработки, нет эффективных средств терапии [11]. Вместе с тем получены монокло-нальные антитела мыши, способные обеспечивать защиту модельных животных от летальных доз вируса Эбола [12]. Однако гетерологичность таких иммуноглобулинов ограничивает их использование для терапии филовирусных лихорадок человека. Именно поэтому получение рекомбинант-ных полноразмерных антител человека против вируса Эбола представляет большой интерес.

Цель данной работы - создание на основе генов, кодирующих вариабельные домены одноце-почечного антитела 4С1 (scFv 4D1) [13], отобранного ранее из комбинаторной синтетической фаговой библиотеки scFv-антител человека [14], двух рекомбинантных плазмидных ДНК, одна из которых кодирует синтез легкой, а другая тяжелой цепи полноразмерного моноклонального человеческого антитела. Совместная трансфекция этими плазмидами клеточных линий млекопитающих должна обеспечивать, по нашим предположениям, биосинтез полноразмерных человеческих антител класса IgG1, взаимодействующих с нуклеопротеи-ном вируса Эбола.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Ранее в ГНЦ ВБ "Вектор" из комбинаторной синтетической библиотеки одноцепочечных антител человека с использованием технологии фа-

гового дисплея были отобраны экспонированные на поверхности нитчатого бактериофага scFv, специфичные к вирусу Эбола [13]. В результате исследования иммунохимических свойств полученных антител было выбрано одноцепочечное антитело 4D1, специфичное к нуклеопротеину вируса Эбола, как наиболее перспективное для дальнейших исследований. Была установлена нуклео-тидная последовательность фрагментов ДНК, кодирующих scFv 4D1 в плазмиде pHen4D1. В лаборатории инженерии белка ИБХ им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова были ранее клонированы гены константных областей иммуноглобулинов человека. Таким образом, исходным генетическим материалом для создания целевых конструкций послужили плазмиды: а) pHen4D1, содержащая ген одноцепочечного антитела 4D1, взаимодействующего с вирусом Эбола [14]; б) pBVK14a2 и pBVK1-6 [15], содержащие лидер-ные последовательности соответственно тяжелой и легкой цепей мышиного моноклонального антитела F10; в) pCIgGl, содержащая ген, кодирующий константные домены CH1-CH2-CH3 тяжелой цепи IgG1 человека, встроенный между сайтами эндо-нуклеаз рестрикции ApaI и XhoI [1б]; г) pCkap, содержащая ген, кодирующий каппа-домен легкой цепи IgG человека [16].

Полноразмерные гены легкой и тяжелой цепей AT-VE получали с помощью полимеразной цепной реакции в присутствии соответствующих олиго-нуклеотидных праймеров (1)—(13) путем объединения генов, кодирующих лидерную последовательность легкой цепи МкАТ F10 и каппа-домен легкой цепи IgG человека, с геном, кодирующим вариабельный фрагмент легкой цепи scFv 4D1, и аналогичным объединением генов, кодирующих лидерную последовательность тяжелой цепи МкАТ F10 и константные Cн1-Cн2-Cн3-домены IgG1 человека, с геном, кодирующим вариабельный домен тяжелой цепи scFv 4D1 (рис. 1).

CCTTCCCTAGGTCGGACTGTGGCTG (1) XmaJI

CTCATGGGTCTTCTGAGCTGACTC (2)

CTCAGAAGACCCATGAGCACCAG (3)

CTGTACTTGTCATCTATGG (4)

GAGCCAGAGAATCGGTCTG (5)

CCTTCGGGCCCTTGGTGGAGGCACTCGAGACGGTGACC (6) ApaI

CCAAGCAGAGGTGCAGCTGGTGGAG (7)

CTGCACCTCTGCTTGGGCACTTTG (8)

GCTCCAGGGAAGGGGCTG (9)

CTGGAGATGGTGAATCGGC (10)

AAGCTGGCTAGCAGGCAAGG (11)

NheI

CCATTCAGATCCTCTTCTGA (12)

AAGCTGGCTAGCCACTTCTTAG (13)

NheI

Подчеркнуты последовательности, соответствующие участкам узнавания рестриктаз.

ХтаЛ

LPL VL

Двухступенчатая ПЦР с введением сайта №е!

XhoI

Ст

ПЦР с введением сайта ХтаЛ

№е!

ХтаЛ

ХтаЛ

XhoI

+

LPт

Nhel

CL

лигирование ХтаЛ XhoI

LPг

V:

Ара1

СТ

(а)

LPн

Двухступенчатая ПЦР с введением сайта №е!

NheI

Ара1

С

Н1

Ара1

+

LPн Vн

NheI

С

н1

лигирование Ара1

LPн

С

н1

С

(б)

XhoI

С

Н2

С

Н3

ПЦР с введением сайта Ара1

XhoI

СН2 СН3

XhoI

н2

С

Н3

Рис. 1. Схема конструирования генов легкой (а) и тяжелой (•) цепей рекомбинантного полноразмерного человеческого антитела против ВЭ. LPL, LPн - лидерные последовательности; Vн - вариабельные домены легкой и тяжелой цепей соответственно; ^1, Cн2, Cнз - константные домены.

Сборка полноразмерного гена легкой цепиЛТ-УЕ

Вариабельный домен легкой цепи scFv 4D1 объединяли с лидерной последовательностью легкой цепи мышиного МкАТ F10. Для этого в первой ступени ПЦР амплифицировали ген, кодирующий лидерную последовательность, используя в качестве матрицы плазмиду pBVK1-6 [15] в присутствии праймеров (3) и (11), а также последовательность, кодирующую вариабельную область легкой цепи scFv 4Dl, на матрице плазмиды pHen4D1 в присутствии праймеров (2) и (12). Продукты амплификации двух генных фрагментов

после выделения из агарозного геля объединяли и использовали в качестве матрицы для второй ступени ПЦР в присутствии праймеров (11) и (12). Полученный фрагмент ДНК, кодирующий ли-дерную последовательность и вариабельный домен легкой цепи, обрабатывали рестриктазой XmaЛ.

Последовательность ДНК, кодирующая каппа-домен IgG, была ранее встроена в плазмиду pCkap [16]. Для ее объединения с геном легкой цепи scFv 4D1 необходимо было ввести сайт XmaЛ в 5'-конец, так как этим уникальным сайтом закан-

+

+

BglII BglII

Рис. 2. Схема строения плазмид pCL1 (а) и pCН1 (•). Указаны сайты эндонуклеаз рестрикции. Рсту - цитомегалови-русный промотор; LPL, LPн - сигнальные последовательности; CL - вариабельный и константный участки гена легкой цепи рекомбинантного антитела; Ун, Сн - вариабельный и константный участки гена тяжелой цепи реко

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

Показать целиком