Ш
БИООРГАНИЧЕСКАЯ ХИМИЯ, 2014, том 40, № 4, с. 433-442
УДК 579.871.1112.016:616.9
РЕКОМБИНАНТНЫЕ ФЛУОРЕСЦЕНТНЫЕ МОДЕЛИ ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЯ ДИФТЕРИЙНОГО ТОКСИНА
© 2014 г. А. Ю. Лабынцев*, #, Н. В. Короткевич*, К. Ю. Манойлов*, А. А. Кабернюк**, Д. В. Колибо*, С. В. Комисаренко*
*Институт биохимии им. А.В. Палладина Национальной академии наук Украины, ул. Леонтовича, 9, Киев, 01601, Украина **Albert Einstein College of Yeshiva University, 1300 Morris Park Avenue Bronx, NY 10461, USA Поступила в редакцию 27.12.2013 г. Принята в печать 25.02.2014 г.
Дифтерийный токсин (ДТ) является основным фактором патогенности возбудителя дифтерии Corynebacterium diphtheriae. Благодаря небольшому размеру токсин представляет значительный интерес для создания искусственных белковых молекул с транспортирующей функцией, например, иммунотоксинов. В работе описана экспрессия и характеристика нетоксичных рекомбинантных флуоресцентных производных ДТ и его нетоксичной мутантной формы CRM197. Полученные белки могут использоваться для исследований рецепторсвязывающей и транспортной функций ДТ в клетках и уровня экспрессии рецептора токсина proHB-EGF на мембранах, для иммунизации и получения специфичных к токсину антител, а также при разработке диагностических тест-систем для определения ДТ и специфичных антител.
Ключевые слова: рекомбинантные нетоксичные аналоги бактериальных токсинов, флуоресцентные белки, молекулярное клонирование, proHB-EGF.
DOI: 10.7868/S0132342314040083
ВВЕДЕНИЕ
Дифтерийный токсин — представитель бактериальных белковых экзотоксинов, обладающий чрезвычайно высокой токсичностью. Он является основным фактором патогенности бактерии Corynebacterium diphtheriae. Токсин синтезируется бактерией лишь после лизогени-зации генома C. diphtheriae коринефагом в, несущим ген функционально активного токсина [1]. ДТ синтезируется в виде одной полипептидной цепи, имеющей в своей структуре два дисульфидных мостика. Токсин массой 58.36 кДа представляет собой профермент, который после протеолити-ческого расщепления образует две части: ферментативную часть — субъединицу А (SbA) и транспортную часть — субъединицу B (SbB) [2, 3]. Молекула токсина состоит из трех доменов: ката-
# Сокращения: ДТ — дифтерийный токсин; BSA — бычий сывороточный альбумин; DABCO — 1,4-диазобициклооктан; IPTG — изопропил-Р^-1-тиогалакгопиранозид; LD — летальная доза; PBS — физиологический фосфатный раствор; proHB-EGF — предшественник гепаринсвязывающего фактора роста клеток, подобного эпидермальному фактору роста; PVA — поливиниловый спирт; Rd — R-домен ДТ SbA и SbB — А и B-субъединицы ДТ; SOE-PCR — ПЦР с использованием сплайсинга через перекрывающиеся концы. #Автор для переписки (тел.: +380-(44) 234-33-54; эл. почта: lab.andrey@gmail.com).
литического — С-домена, который соответствует SbA, транспортного — Т-домена и рецепторсвязы-вающего — R-домена (Rd); последние два образуют SbB [3, 4]. R- и Т-домены участвуют в транспорте каталитического домена в цитозоль клетки, и, соответственно, токсических свойств не проявляют, а С-домен отвечает за цитотоксическую активность токсина.
Рецептором ДТ на поверхности клеток выступает мембраносвязанная молекула proHB-EGF (от англ. "progenitor of heparin-binding epidermal growth factor-like growth factor") [5], с которой взаимодействует Rd [6]. Связывание ДТ запускает процесс клатринзависимого эндоцитоза комплекса токсин-рецептор внутрь клеток в составе эндосом. В процессе эндоцитоза происходит про-теолитическое расщепление токсина (процес-синг), после которого SbA и SbB остаются соеди-тенными только дисульфидным мостиком [7]. Понижение эндосомального рН приводит к кон-формационным изменениям в структуре Т-доме-на, который приобретает липофильные свойства и способность проникать через мембрану эндосо-мы [8]. С-домен после транслокации в цитозоль отсоединяется от Т-домена вследствие восстановления дисульфидной связи присутствующим в цитозоле глутатионом. В дальнейшем С-домен
способен АЭР-рибозилировать внутриклеточную мишень — эукариотический фактор элонгации еББ-2 по особому аминокислотному остатку — дифтамиду, являющемуся посттрансляционной модификацией гистидина. Такая модификация еББ-2 обусловливает остановку биосинтеза белков в клетке, что приводит к ее гибели. Более подробно схема действия токсина описана в обзоре [9].
Полулетальная доза ЬВ50 ДТ для человека составляет менее 100 нг на кг массы тела [10], что характеризует его как высокотоксичный белок. Согласно Статье 1.1 "Конвенции о запрещении разработки, производства и накопления запасов бактериологического (биологического) и токсин-ного оружия и об их уничтожении": "Каждое государство — участник настоящей Конвенции обязуется никогда, ни при каких обстоятельствах не разрабатывать, не производить, не накапливать, не приобретать каким-либо иным образом и не сохранять: микробиологические или другие биологические агенты, или токсины..." [11]. Настоящая Конвенция, создавая условия для более безопасных исследований и уменьшения рисков двойного использования результатов исследований (как для мирных целей, так и для военных нужд), значительно усложняет изучение бактериальных токсинов. Преодолению данной ситуации посвящена вторая часть Статьи 1.1 Конвенции, согласно которой существует возможность проведения работ с микробиологическими или другими биологическими агентами, или токсинами, если они " предназначены для профилактических, защитных или других мирных целей". В случае ДТ это означает возможность использования иммуно-токсинов на его основе, в которых Я-домен заменен на лиганд для рецепторов с высокой экспрессией на опухолевых клетках.
Так, например, в работах [12, 13] для исследований функциональной активности ДТ был получен его аналог, включающий вместо Я-домена интерлейкин-2 (ПАБ3891Ь-2), однако его взаимодействие с рецептором ргоИБ-БОБ может отличаться от действия нативного токсина. Ранее нами предложена альтернативная конструкция для исследования рецепторсвязывающей и транспортной функции ДТ — нетоксичный аналог БОБР-ЗЬБ, который имеет в своем составе Я- и Т-домены ДТ, а также содержит зеленый флуоресцентный белок БОБР вместо цитотоксичного С-домена [14].
Цель данной работы — получение рекомби-нантных мутантных форм и флуоресцентных аналогов ДТ, которые были бы пригодны для исследования его рецепторсвязывающей и транспортной функции при отсутствии токсических свойств.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
В результате работы получены нетоксичные ре-комбинантные аналоги ДТ а именно: флуоресцентные производные на основе зеленого флуоресцентного белка EGFP — EGFP-Rd, красного флуоресцентного белка mCherry — mCh-Rd и mCh-SbB и рН-чувствительного оранжевого флуоресцентного белка mNectarine — mNect-Rd и mNect-SbB, а также полноразмерная нетоксичная форма ДТ CRM197 (рис. 1). Применение двух разных флуоресцентных белков — EGFP и mCherry расширяет спектр возможных флуоресцентных зондов внутриклеточных компонентов при исследовании внутриклеточного транспорта ДТ. Кроме того, для изучения изменений рН при внутриклеточном транспорте фрагментов ДТ были получены белки с mNectarine. В аналогах mCh-SbB и mNect-SbB флуоресцентные белки mCherry или mNectarine заменяли С-домен на N-конце молекул (рис. 1), таким образом, рекомбинантные белки сохраняли рецепторсвязывающую и транспортную функцию и легко детектировались с помощью соответствующих методов анализа, однако не обладали токсичными свойствами. Получены также флуоресцентные укороченные аналоги mCh-Rd, EGFP-Rd и mNect-Rd, в которых от исходного ДТ сохранялся только R-домен.
Генетические конструкции, кодирующие белки mCh-SbB, mNect-SbB, mCh-Rd, EGFP-Rd и mNect-Rd, получали путeм амплификации специфическими праймерами нуклеотидных последовательностей SbB ДТ и Rd ДТ из лизатов C. diphtheriae штамма NCTC 10648 и флуоресцентных белков EGFP, mCherry и mNectarine из плазмид pEGFP-N1, pmCherry и pBAD-mNectarine. Эти праймеры поданы в таблице. Полученные нук-леотидные последовательности флуоресцентных белков и SbB ДТ или Rd ДТ объединялись в единую рамку считывания и вводились в экспрессион-ные векторы pET-24a и pET-28a с образованием плазмид pET-24a-mCh-SbB, pET-28a-mNect-SbB, pET-24a-mCh -Rd, pET-24a-EGFP-Rd и pET-28a-mNect-Rd. Данными плазмидами трансформировали бактерии E. coli штамма BL21 Rosetta (DE3) и отбирали колонии с высоким уровнем экспрессии необходимых белков.
Для получения полноразмерного нетоксичного белка CRM197 проводили направленный мутагенез гена ДТ с целью изменения триплета, кодирующего глицин в положении 52 на кодон глута-миновой кислоты. Данная мутация инактивирует SbA ДТ, но не влияет на функцию SbB [15].
Направленный мутагенез проводили методом SOE-PCR [16] с использованием двух пар прайме-ров из таблицы с нуклеотидной заменой для получения двух фрагментов токсина: первый содержал замену на конце нуклеотидной последовательности, а второй — в начале. Прямые праймеры 1-го
С-домен T-домен R-домен
Дифтерийный токсин
С-домен
T-домен
R-домен
CRM197
Старт-кодон
£
X
Т7-тег BamHI Gly52Glu
XhoI
Стоп-кодон His-тег
mCherry
T-домен
R-домен
mCh-SbB
Старт-кодон
С
Т7-тег BamHI
AatlI
XhoI
Стоп-кодон His-тег
mCherry
R-домен
mCh-Rd
Старт-кодон
9
Т7-тег BamHI
AatIIXhoI
Стоп-кодон His-тег
EGFP R-домен
EGFP-Rd -
Старт-кодон
m
Стоп-кодон Т7-тег BamHI AatIIXhoI His-тег
mNectarine
Т-домен
R-домен
mNect-SbB
Старт-кодон
Ы18-те^Т7-- B ыт Сайт расщепления 17 тег BamHT
тромбином
mNectarine
R-домен
Стоп-кодон
XhoI
mNect-Rd
Старт-кодон His-тег
Сайт расщепления ' Т7-тег BamHI тромбином
AatII Стоп-кодон XhoII
Рис. 1. Схема генетических конструкций, кодирующих белки CRM197, mCh-SbB, mCh-Rd, EGFP-Rd, mNect-SbB и mNect-Rd.
фрагмента и обратные праймеры 2-го были комплементарны, соответственно, нуклеотидные последовательности фрагментов 1 и 2 также были ча-
стично комплементарны. После смешивания фрагментов 1 и 2 была проведена достройка нуклеотидной последовательности полноразмер-
Последовательности праймеров, использованных в работе
Название Последовательность 5' ^ 3'
SbA sence Bam ACTGGATCCGGC
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.