ш
БИООРГАНИЧЕСКАЯ ХИМИЯ, 2014, том 40, № 5, с. 550-559
УДК 577.112.4
РЕКОМБИНАНТНЫЙ ГРАНУЛОЦИТАРНЫЙ КОЛОНИЕСТИМУЛИРУЮЩИЙ ФАКТОР (ФИЛГРАСТИМ) С ПРОЛОНГИРОВАННЫМ ХАРАКТЕРОМ ДЕЙСТВИЯ: ОПТИМИЗАЦИЯ УСЛОВИЙ ВЫДЕЛЕНИЯ И ОЧИСТКИ ИЗ ТЕЛЕЦ ВКЛЮЧЕНИЯ
© 2014 г. Н. В. Кононова*, А. В. Яковлев, А. М. Журавко, Н. Н. Панкеев, С. В. Минаев,
А. И. Бобрускин, В. А. Мартьянов
Российская фармацевтическая компания ЗАО "Мастерклон",
119019, Москва, ул. Ленивка, д. 3, стр. 11 Поступила в редакцию 04.02.2014 г. Принята к печати 11.04.2014 г.
Разработана единая технологическая платформа производства двух лекарственных препаратов на основе рекомбинантного гранулоцитарного колониестимулирующего фактора человека (филграс-тима), обладающих непролонгированным и пролонгированным характером действия. Унифицированная технология позволила не только удешевить производство ранее разработанного отечественного лекарственного средства, но и за счет введения в единую технологическую линию дополнительной стадии пэгилирования рекомбинантного гранулоцитарного колониестимулирующего фактора наладить выпуск лекарственного средства нового поколения, а также стандартизировать процедуру документирования технологического процесса в соответствии с требованиями GMP.
Ключевые слова: полиэтиленгликоль (PEG); гранулоцитарный колониестимулирующий фактор (GCSF); филграстим; фебрильная нейтропения.
DOI: 10.7868/S0132342314050169
ВВЕДЕНИЕ
Лечение онкологических заболеваний в настоящий момент является одной из самых актуальных задач здравоохранения. Важнейшая составляющая этого лечения — коррекция побочных цитотоксических эффектов противоопухолевой химиотерапии. Нейтропения — заболевание крови, характеризующееся пониженным содержанием в ней нейтрофилов, возникает как один из таких побочных эффектов. Наиболее тяжелой и опасной для пациентов формой нейтропении является фебрильная нейтропения (ФН) — состояние, сопровождающееся снижением количества нейтрофилов менее 0.5 х 109/л. При развитии ФН назначают антибиотики (препараты первой линии), а также гомопоэтические цитокины [1, 2].
Антибиотикотерапия имеет ряд существенных недостатков. Необходимо, с одной стороны, учи-
Сокращения: PEG — полиэтиленгликоль; GCSF — человеческий гранулоцитарный колониестимулирующий фактор; PEG-GCSF — пэгилированный GCSF; АФС — активная фармацевтическая субстанция; ЛС — лекарственное средство; ИОХ — ионообменная хроматография; ХГВ — гидрофобная хроматография; ГХ — гель хроматография; ФН — фебрильная нейтропения.
#Автор для связи (тел/факс: +7 (916) 973-25-27; эл.почта: nvkononova@rambler.ru).
тывать таксономическую структуру возбудителей инфекционных осложнений и их чувствительность к антибиотикам, а с другой стороны, кумулятивную токсичность используемых при этом цитостатиков, обладающих сходным спектром побочных эффектов. Кроме этого, антибиотики могут, как активировать, так и угнетать функциональную активность нейтрофилов пациентов [3]. В связи с этим, в течение последних двух десятилетий большое внимание уделяется естественному стимулятору роста нейтрофилов — гранулоцитар-ному колониестимулирующиму фактору (ОС8Б). Его рекомбинантные аналоги представляют собой новый класс лекарственных соединений (ЛС), действие которых направлено на пролиферацию клеток-предшественников нейтрофилов, диффе-ренцировку и активацию зрелых клеток, усиливая при этом их фагоцитирующую способность и ан-тителозависимую цитотоксичность [4, 5].
Первый рекомбинантный вариант ОС8Б ("Филграстим") был разрешен в США в 1991 г. для клинического применения у онкологических больных, получивших химиотерапию [6, 7]. Сегодня на российском фармацевтическом рынке доступны три типа ЛС, в которых в качестве активной фармацевтической субстанции (АФС) используется гликозилированный, негликозилированный или
пэгилированный варианты рекомбинантного GCSF человека. Под торговой маркой "Ленограстим" (зарегистрирован в Европе и Японии в 1993 г.) продается препарат, где в качестве АФС используется гликозилированный вариант GCSF. Он синтезируется с помощью эукариотической системы экспрессии и поэтому, подобно природному белку, посттрансляционно модифицирован в положении Туг133 [8—10]. Рекомбинантный вариант GCSF, полученный с помощью прокариотической системы экспрессии, в отличие от О-гликозилированного природного белка, не модифицирован, но также применяется в качестве АФС в препаратах под торговой маркой "Филграстим" [7, 8, 10—13]. Кова-лентная модификация негликозилированного варианта GCSF полиэтиленгликолем (PEG, М 20 кДа) привела к созданию препарата с пролонгированным действием (PEG-GCSF, "Неуластим", Ля-Рош, Швейцария), применяющегося в виде разовой инъекции на всю продолжительность курса химиотерапии в отличие от филграстима и ленограстима, требующих ежедневных инъекций [14—16].
Принимая во внимание значимость первичной профилактики ФН как фактора предупреждения негативных клинических последствий терапии пациентов с онкологическими заболеваниями, необходимо повысить доступность на российском фармацевтическом рынке такого ЛС, как PEG-GCSF. Таким образом, основной целью данной работы была разработка высокоэффективного промышленного производства PEG-GCSF, позволяющего выпускать АФС фармакопейного качества с более низкой стоимостью, чем у оригинального препарата "Неуластим".
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Получение ЛС на основе PEG-модифициро-ванных белков на практике представляет собой достаточно сложную и комплексную задачу, одним из этапов решения которой, является разработка метода очистки целевого модифицированнного белка, обеспечивающего высокий выход биологически активного продукта фармакопейного качества. Это объясняется тем, что модифицированная молекула обладает принципиально новыми физико-химическими свойствами. С одной стороны, очистка пэгилированного белка от не вступившего в реакцию не представляет особой сложности, с другой, разделение различных PEG-производных друг от друга является основной преградой при получении чистого лекарственного препарата [17]. В настоящее время многие физико-химические свойства PEG- коньюгатов еще в полной мере не изучены, поэтому основные пути очистки таких макромолекул основываются на классических методах разделения модифицированных белков [18, 19].
В 2009 году нами была разработана лабораторная схема выделения и очистки GCSF из телец
включения (ТВ) клеток Escherichia coli, которая дала возможность реализовать опытно-промышленное производство АФС "Филграстим" [20]. В соответствии с целью данного исследования процессы пэгилирования GCSF и очистки конъюгата PEG-GCSF было решено осуществить в виде дополнительных стадий в технологической схеме, уже разработанной для производства АФС фил-грастима.
Ранее было показано, что эффективная модификация ренатурированной формы GCSF происходит при концентрации белка 12 мг/мл в №3-цитрат буферной системе при значении рН 6.0, а предварительная стадия ренатурации при рН 8.0 [21]. Чтобы соединить все процессы в единую цепочку, после процедуры солюбилизации ТВ и ренатурации провели оптимизацию условий первичного фракционирования рекомбинантного GCSF. С этой целью была изучена зависимость выпадения из раствора конформационно нестабильных форм рекомби-нантного белка в двух буферных системах. Был проведен ряд экспериментов, в которых рН растворов белка в Na-ацетатной и №3-цитратной буферных системах варьировался в диапазоне значений 8.0—4.0. Любое снижение значения рН ниже 6.5 приводило к помутнению реакционной смеси, однако основная масса нестабильных форм белка выпадала из раствора при значении рН ~ 6.2. Кроме этого, при значениях рН ниже 6.0 происходили дополнительные потери целевого белка за счет его соосаждения с примесными белками, в результате чего в растворе резко понижалась концентрация рекомбинантного GCSF.
На рис. 1 приведены данные анализа рекомби-нантных конформеров GCSF с помощью офВЭЖХ (пики 1, 2 и 3), демонстрирующие содержание и конформацию целевого белка после солюбилиза-ции ТВ (рис. 1а), ренатурации белка в буферном растворе при значении рН 8.0 (рис. 1б) и в условиях понижения рН до значения 6.0 (рис. 1в). Эти данные позволили сделать вывод о том, что выпадение в осадок нестабильных форм GCSF происходит при переходе значений рН в кислую область через его изоэлектрическую точку (6.2) и может приводить к дополнительной очистке целевого продукта.
Во время наработки 20 опытно-промышленных серий АФС "Филграстим" было замечено, что связывание белка в колонне, заполненной ионообменным носителем SP-Sepharose FF в буферном растворе, содержащем 50 мМ CH3COONa (рН 4.0), происходило полностью, однако потери на стадии десорбции (градиентное элюирование) составляли 45—50% от исходного количества. Необходимость разработки промышленной схемы очистки PEG-GCSF на базе технологической линии получения GCSF послужила толчком для доработки данной стадии.
мин
Рис. 1. Анализ рекомбинантных конформеров GCSF (1, 2 и 3) с помощью офВЭЖХ после солюбилизации телец включения (а), ренатурации белка при рН 8.0 (б) и понижения значения рН буферной системы до 6.0 (в). Пик 2 — ренатурированный GCSF; пик 3 — солюбилизированный GCSF; пик 1 — нестабильные формы GCSF.
Важным фактором, оказывающим определяющее влияние на процесс ионообменной хроматографии, является состав буферных растворов. Для подбора подходящего режима ИОХ в целях замены 50 мМ Na-ацетатной смеси была проведена оценка параметров раствора 5 мМ №3-цитрата для его использования в качестве элюента при ИОХ на SP-Sepharose FF. При этом было показано, что, несмотря на снижение концентраций компонентов стартового буферного раствора, и, как следствие, снижения электропроводности,
замена ОН^ОО^-иона на C6H5O7 -ион приводит к снижению потерь белка на стадии десорбции и позволяет довести выход целевого продукта до 70—75%. Скорее всего, это объясняется тем,
з—
что C6H5O7 -анионы это ионы лиотропного ряда; по сравнению с CH3COO- они больше усиливают степень дезориентации молекул воды, что равноценно повышению температуры растворителя и гидратируемости растворенных веществ. Возможно, изменяя "структурную темпер
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.