научная статья по теме РЕКОМБИНАНТНЫЙ TNF-СВЯЗЫВАЮЩИЙ БЕЛОК ВИРУСА НАТУРАЛЬНОЙ ОСПЫ КАК ПОТЕНЦИАЛЬНЫЙ TNF-АНТАГОНИСТ НОВОГО ПОКОЛЕНИЯ Химия

Текст научной статьи на тему «РЕКОМБИНАНТНЫЙ TNF-СВЯЗЫВАЮЩИЙ БЕЛОК ВИРУСА НАТУРАЛЬНОЙ ОСПЫ КАК ПОТЕНЦИАЛЬНЫЙ TNF-АНТАГОНИСТ НОВОГО ПОКОЛЕНИЯ»

УДК 578.821

РЕКОМБИНАНТНЫЙ TNF-СВЯЗЫВАЮЩИЙ

БЕЛОК ВИРУСА НАТУРАЛЬНОЙ ОСПЫ КАК ПОТЕНЦИАЛЬНЫЙ TNF-АНТАГОНИСТ НОВОГО ПОКОЛЕНИЯ

© 2009 г. И.П. Гилева*, Т.С. Непомнящих, И.А. Рязанкин, С.Н. Щелкунов

ФГУН Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» Роспотребнадзора, 630559Кольцово Новосибирской обл.; факс: (383)336-7409, электронная почта: gileva@vector.nsc.ru snshchel@vector.nsc.ru

Поступила в редакцию 03.04.08 После доработки 25.05.09

Гель-фильтрацией лизатов клеток насекомых линии Sf21, инфицированных рекомбинантным вирусом BVi67, содержащим ген TNF-связывающего белка (CrmB) вируса натуральной оспы (VARV), обнаружено, что hTNF-нейтрализующая активность ассоциируется, в основном, с фракциями, соответствующими белкам с молекулярными массами более 500 кДа, и, в меньшей степени, с фракциями, соответствующими белкам 270 и 90 кДа. Методом аффинной хроматографии из лизатов инфицированных клеток выделен реком-бинантный белок VARV-CrmB. Показано, что различие между экспериментально определенной и теоретически ожидаемой молекулярными массами VARV-CrmB объясняется гликозилированием рекомбинантно-го белка в клетках насекомых. In vitro VARV-CrmB нейтрализует цитотоксическое действие hTNF и hLTa, причем эффективность нейтрализации hTNF на 2—3 порядка превышает аналогичные эффекты растворимых клеточных TNF-рецепторов I и II типов, соизмерима с активностью mAb MAK195 и несколько уступает активности коммерческого препарата Remicade.

КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: фактор некроза опухолей, TNF-связывающий белок, вирус натуральной оспы, ви-роцепторы, септический шок.

Ключевую роль в развитии воспалительных и иммунных реакций организма человека играют фактор некроза опухолей (TNF) и лимфоток-син (LT), которые, взаимодействуя с клеточными рецепторами TNFRI (p55) и TNFRII (p75) [1, 2], запускают каскад внутриклеточных реакций. Однако гиперпродукция этих цитокинов и, как следствие, чрезмерная активация соответствующих рецепторов, приводит к развитию хронического воспаления и разрушению тканей [3].

Принятые сокращения: CPXV (cowpox virus) — вирус оспы коров; Crm (cytokine response modifier) — модификатор цитокинового ответа; Fc (constant fragment) — фрагмент константной части молекулы иммуноглобулина; LT (lym-photoxin) — лимфотоксин; MPXV (monkeypox virus) — вирус оспы обезьян; mAb (monoclonal antibody) — моноклональ-ное антитело; TNF (tumor necroses factor) — фактор некроза опухолей; TNFRI и TNFRII (tumor necroses factor receptor) — клеточные рецепторы TNF I и II типа; TNFsR (soluble tumor necroses factor receptor) — растворимый клеточный рецептор TNF; VARV (variola virus) — вирус натуральной оспы; aKr— агкислый гликопротеин.

* Адресат для корреспонденции.

Иммунокоррекция подобных заболеваний включает применение лекарственных препаратов, ингибирующих синтез и процессинг вышеуказанных цитокинов, а также предотвращающих взаимодействие цитокинов с эффекторны-ми клетками [4]. Среди последней группы можно выделить препараты, действующим началом которых являются моноклональные антитела (Infliximab, Adalimumab) [5—7] или рекомбинант-ные химерные белки, состоящие из TNF-рецеп-торных и иммуноглобулиновых доменов (Eta-nercept) [8, 9]. Несмотря на то, что некоторые TNF-блокаторы — Remicade®(Centocor, «Inc., Malvern», США), Enbrel® («Immunex Corp.», США), Humira™ («Abbott Laboratories», США), действующим началом которых являются Infliximab, Etanercept и Adalimumab соответственно, прошли клинические испытания и разрешены для применения в медицинской практике, имеются противопоказания для их применения (наличие у пациентов сердечно-сосудистых заболеваний [10], туберкулеза [11], латентных вирусных инфекций [12]). Кроме того, ука-

занные препараты не являются универсальными. Например, Etanercept оказался эффективным при терапии ревматоидного артрита [13], но не септического шока [14]. Таким образом, поиск новых TNF-антагонистов остается до настоящего времени актуальной задачей.

Вирус натуральной оспы (VARV) является особо опасным патогеном человека. В процессе эволюции этим вирусом освоены различные механизмы преодоления иммунного ответа [15]. В частности, вирусный геном детерминирует синтез секретируемых белков — вироцепторов, имеющих структурное сходство с клеточными рецепторами цитокинов [16]. Вирусные белки функционируют как связывающие цитокины растворимые рецепторы, блокируя таким образом их активность. Ранее мы получили рекомбинант-ный бакуловирус BVi67, несущий ген TNF-свя-зывающего белка VARV (VARV-CrmB), показали, что культуральная среда клеток Sf21, инфицированных этим рекомбинантным бакулови-русом, обладает TNF-нейтрализующей активностью [17, 18] и разработали метод выделения рекомбинантного вирусного белка [19]. Оказалось, что TNF-связывающий белок VARV обладает существенно более выраженной TNF-нейт-рализующей активностью в экспериментальных системах in vitro и in vivo по сравнению с аналогичными белками вирусов оспы обезьян (MPXV) и оспы коров (CPXV) [20].

Целью настоящего исследования является подробная характеризация продуцируемого в клетках насекомых рекомбинантного белка VARV-CrmB как потенциального TNF-антаго-ниста. Для этого мы проанализировали, в какой форме синтезируется данный белок в клетках насекомых, а в экспериментах in vitro оценили эффективность нейтрализации цитотоксичес-кого действия hTNF относительно известных TNF-антагонистов — моноклонального TNF-нейтрализующего антитела МАК 195 [21], растворимых клеточных рецепторов TNFRI, TNFRII и препарата Remicade® [22].

МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Материалы. Для культуральных работ использовали 96-луночные планшеты фирмы «Orange Scientific» (США), среду Грейса, антибиотики и Z-глютамин фирмы «Gibco/BRL» (США), среду DMEM производства ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор» (Россия), эмбриональную сыворотку коров производства ООО «БИОЛОТ» (Россия). Также в работе использовали: BrCN-сефарозу 4В («Amer-sham Pharmacia Biotech», США), растворимые клеточные рецепторы TNFsRI and TNFsRII

(«R@D Systems», США), краситель кумасси синий R250 («Sigma», США), наборы для окрашивания гликопротеинов (GelCode glycoprotein staining kit) и определения процентного содержания углеводных остатков (Glycoprotein carbohydrate estimation kit) («Pierce», США). Препараты рекомбинантных цитокинов [hTNF (6 • 107 ед/мг) и hLTa (107 ед/мг)] любезно предоставлены Н.М. Пустошиловой (ООО «Инженерная иммунология», Россия). TNF-нейтрализующие мо-ноклональные антитела МАК195 и препарат Remicade любезно предоставлены Г.М. Игнатьевым (ГИСК им. Тарасевича, Россия). Ампула препарата Remicade содержит 100 мг infliximab, 500 мг сахарозы, 0,5 мг Tween-80, 2,2 мг NaH2PO4 и 6,1 мг Na2HPO4.

Культуры клеток. Линии клеток хлопковой совки Spodoptera frugiperda Sf21 и мышиных фиб-робластов L929 получены из коллекции культур клеток ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор». Клетки линии Sf21 культивировали при 27° в среде Грейса с добавлением 10% эмбриональной сыворотки коров, 2 мМ Z-глютамина, 100 ед/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина. Клетки линии L929 культивировали в атмосфере 5% CO2 при 37° в среде DMEM с теми же добавками.

Гель-фильтрация лизатов инфицированных клеток насекомых. Клетки Sf21, инфицированные рекомбинантным бакуловирусом BVi67, экспрессирующим VARV-CrmB [17], ресуспен-дировали в ростовой среде и полученную суспензию подвергали трехкратному циклу замораживания—оттаивания. После удаления дебриса низкоскоростным центрифугированием супер-натант наносили на колонку размером 2,5 х 84 см с биогелем A-0,5m (100—200 mesh, «BioRad», США), уравновешенную 10 мМ Tris-HCl-буфе-ром, pH 8,0. Скорость гель-фильтрации — 25 мл/час. Объем фракции — 4 мл.

Используемый тип смолы, согласно спецификации фирмы-производителя, позволяет фракционировать белки в диапазоне 10—500 кДа. Для калибровки колонки использовали следующие белки-стандарты: овальбумин (45 кДа), БСА (66 кДа), каталазу (232 кДа), ферритин (440 кДа) («Serva», Германия) и декстран голубой (2000 кДа; «Sigma», США), маркирующий свободный объем колонки. Концентрацию белков во фракциях определяли спектрофотометрически на приборе Ultraspec 3000 («Amersham pharmacia biotech», США). TNF-нейтрализующую активность в полученных фракциях определяли, как описано в работе [18].

Анализ гликозилирования рекомбинантного белка. Выделение рекомбинантного белка VARV-CrmB из инфицированных клеток насекомых Sf21 проводили методом аффинной хро-

матографии как описано в работе [19]. Концентрацию белка определяли по методу Брэдфорд

[23]. Электрофоретическое фракционирование белков в ПААГ проводили по методу Лэммли

[24] в редуцирующих и нередуцирующих условиях, что достигалось присутствием или отсутствием 0,2 М 2-меркаптоэтанола (2-МЕ) в буфере для нанесения образцов. Полипептиды окрашивали красителями кумасси синий R250 и GelCode glycoprotein staining согласно рекомендациям фирмы-изготовителя. Степень гликози-лирования рекомбинантного белка VARV-CrmB определяли, используя набор Glycoprotein carbohydrate estimation kit в формате 96-луночных планшетов, сравнивая поглощение исследуемых образцов и стандартных белков, измеряемое на приборе Microplate Reader ELX808 («BIO-TEK INSTRUMENTS, INC.», США) при длине волны 550 нм. В протокол фирмы-изготовителя нами внесено изменение таким образом, что результаты представлены отношением значений поглощения А550 к количеству белка, взятого для анализа (А550/мг).

Определение биологической активности белка VARV-CrmB in vitro. Биологическую активность белка VARV-CrmB и коммерческих антагонистов TNF определяли по их способности ингиби-ровать цитотоксическое действие hTNF (или hLTa) на культуре клеток фибробластов мыши L929 как описано в работе [25]. Результаты выражали в процентном отношении выживших клеток относительно количества клеток в необработанных цитокинами контрольных пробах. Каждая точка бралась в трех повторах, и среднее значение процента выживаемости рассчитывали по формуле:

(ATNF + CrmB — АХОТ)/(Аклетки — ATNF) ' 10°.

Измерение А проводили при длине волны 550 нм.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Характеризация рекомбинантного белка VARV-

CrmB. Рекомбинантный белок V

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

Показать целиком