ГЕНЕТИКА, 2007, том 43, № 7, с. 916-929
^=ОБЩАЯ ^^^^^^^^^^^^^^^^
ГЕНЕТИКА
УДК 577.21:599.32
РЕКОНСТРУКЦИЯ ФИЛОГЕНИИ ОТРЯДА ГРЫЗУНОВ (Rodentia) ПО ДАННЫМ СТРУКТУРНОГО АНАЛИЗА КОРОТКОГО РЕТРОПОЗОНА B1
© 2007 г. Н. А. Вениаминова1, Н. С. Васецкий1, Л. А. Лавренченко2, С. В. Попов3, Д. А. Крамеров1
1 Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгелъгардта Российской академии наук, Москва 119991;
e-mail: kramerov@eimb.ru
2 Институт проблем экологии и эволюции им. А Н. Северцова Российской академии наук, Москва 119991
3 Московский зоопарк, Москва 123242 Поступила в редакцию 28.02.2006 г.
Проведено крупномасштабное исследование короткого ретропозона (SINE) B1 в геномах грызунов, относящихся к большинству известных семейств этого отряда млекопитающих. Нуклеотидные последовательности B1 из грызунов разных семейств обнаруживали целый ряд характерных черт, включающих замены, делеции и тандемные дупликации. Сопоставляя распределение этих черт среди семейств грызунов, тестировали обсуждаемые в настоящее время филогенетические связи в отряде грызунов. Проведенный анализ свидетельствует, в частности: 1) о ранней дивергенции беличьих (Sciuridae) и родственных им семейств (Aplodontidae и Gliridae) от остальных грызунов; 2) о возможной последующей дивергенции бобров (Castoridae); 3) о монофилии группы Hystricognathi, включающей ряд семейств, в том числе таких как дикобразы (Hystricidae) и морские свинки (Cavi-idae); 4) о вероятной монофилии группы, образованной остальными семействами, включая шесть семейств мышеподобных грызунов (Myodonta). Обсуждаются различные подходы к использованию коротких ретропозонов для филогенетических исследований.
Короткие ретропозоны, или SINEs (Short Interspersed Elements), представляют собой мобильные генетические элементы длиной 80-400 пн, размножение которых в геноме происходит через обратную транскрипцию их РНК [1-3]. В качестве обратной транскриптазы короткий ретропо-зон использует полипептид, закодированный в одном из видов длинных ретропозонов, или LINE (Long Interspersed Elements).
В геномах млекопитающих одного вида имеются 2-4 семейства коротких ретропозонов, каждое из которых содержит 104-105 копий, чьи нуклеотидные последовательности обычно обладают 65-90%-ным сходством. Различия между копиями обусловлены как существованием подсемейств коротких ретропозонов, так и мутациями, возникшими после интеграции каждой из копий. По числу таких нуклеотидных замен можно судить о возрасте той или иной копии SINE.
Большинство коротких ретропозонов ведут свое происхождение от молекул тРНК. Однако имеются два класса SINE, чье происхождение связано с другими РНК, синтезирующимися РНК-по-лимеразой III. Один из них включает несколько недавно открытых семейств SINE рыб, произошедших из 5S рРНК [4, 5]. Короткие ретропозоны другого класса (Alu приматов и B1 грызунов) были среди первых описанных SINE [6-9]. Они
ведут происхождение от 7SL РНК - цитоплазма-тической РНК длиной 300 нуклеотидов, которая входит в состав рибонуклеопротеидных частиц (SRP, signal recognition particles), узнающих сигнальный пептид секретируемых и мембранных белков [10]. В процессе возникновения Alu и B1 произошла потеря центральной части 7SL РНК длиной 144-182 нуклеотида (рис. 1). Alu (300 пн) состоит из двух таких сходных, но не идентичных последовательностей, левого (L) и правого (R) мономеров. Alu был найден в геномах всех изучавшихся в этом отношении приматов, включая полуобезьян (Prosimiae), что свидетельствует о возникновении Alu у общего предка всех приматов [11-13].
В отличие от Alu В1-элемент из геномов домовой мыши (Mus musculus) и серой крысы (Rattus norvegicus) представляет собой мономер и имеет длину около 140 пн. Однако в этом элементе имеется внутренняя тандемная дупликация с размером повтора 29 пн, что тоже можно рассматривать как своего рода димеризацию [14]. Наличие делеции длиной 9 пн в центральной части B1 мышей - еще одно отличие B1 от Alu. В геномах этих грызунов обнаружено небольшое число копий B1 без такой дупликации и делеции. Такие копии, названные pB1 (proto-B1), рассматриваются как эволюционные предшественники B1 [15]. В геномах мышей и крыс также обнаружены варианты pB1
7SL РНК
бокс А
бокс В
■ШГ
j;;i I
pB1
поли А
делеция d7, d9 или d10
pB1d7 или pB1d9
B1
pB1d10
B1-dID
V_
MEN
Y
ID
J
V Щ
ша I tä ihn нтатат
B1
dID
I ta I*
B1
__;
Рис. 1. Упрощенная схема, иллюстрирующая происхождение, эволюцию и структуру элемента B1 и родственных ему SINE у грызунов. У общего предка грызунов, приматов и тупай произошло образование ретропсевдогена 7SL РНК, несущего делецию 182 пн, что привело к возникновению элемента pB1. Последующая потеря специфического участка (отмечен черным) длиной 7, 9 или 10 пн привела к образованию новых семейств pB1. Тандемная дупликация участка длиной 29 пн привела к возникновению канонического элемента B1, известного из геномов Mus musculus и Rattus nor-vegicus. Образование 20-нуклеотидной тандемной дупликации в элементе pB1d10 предшествовало возникновению ди-мерных SINE (B1-d1D и MEN). ID - тРНК-родственный SINE, образовавший эти димерные SINE путем слияния с B1. Для последовательностей dID характерна делеция длиной 19 пн. Косой штриховкой отмечены боксы A и B промотора РНК-полимеразы III. Серым цветом и точечной штриховкой помечены участки, входящие в состав тандемных дупликаций.
со специфической делецией длиной 7, 10 или реже 9 пн (pB1d7, pB1d10 и pB1d9 соответственно; рис. 1).
Грызуны (Rodentia) образуют самый обширный отряд млекопитающих, состоящий по крайней мере из 30 семейств [16, 17]. Если B1 у мышей и крыс (сем. Muridae) изучены сравнительно хорошо [18-20], в частности благодаря секвениро-ванию геномов M. musculus [21] и R. norvegicus [22], то этот SINE из геномов других грызунов остается очень мало изученным. Зиткевич и со-авт. [12] показали наличие B1 у бурундука (Sciu-ridae) и морской свинки (Caviidae), но используя секвенирование ПЦР-продуктов эти авторы не могли изучить всю нуклеотидную последовательность этого SINE. Нами было описано два димер-ных SINE, содержащих в качестве мономеров B1 и ID-родственный элемент (ID известен как самостоятельный SINE грызунов, ведущий происхождение от аланиновой тРНК [23]). Первый из них, MEN, выделенный из генома белки Menetes berd-morei, имел левый ID-подобный мономер и B1 в качестве правого мономера [24]. Второй SINE, обнаруженный в геномах белок (Sciuridae) и сонь (Gliridae), имел противоположное расположение мономеров и был назван B1-dID [25]. Важно отметить, что В1-мономер из белок и сонь содержал
внутреннюю дупликацию длиной 20, а не 29 пн, как в B1 мышей и крыс (рис. 1).
Недавно, используя гибридизацию с В1-зон-дом M. musculus, мы показали наличие 7SL РНК-родственных SINE не только у приматов (Alu), но и у грызунов всех 15 тестированных семейств [26], а также тупай (Scandentia) [26, 27], но не у представителей других отрядов млекопитающих. Предварительные опыты по клонированию и се-квенированию геномных фрагментов ДНК подтвердили наличие копий B1 у таких грызунов, как тушканчики, мышовки, белки, бобры и морские свинки [26].
Было показано, что SINE могут быть использованы как надежные маркеры для изучения филогенетических связей. В частности, можно выяснять, имеются ли те или иные семейства SINE в геномах изучаемых организмов [28, 29]. Наличие общего семейства SINE у разных видов свидетельствует об их родстве.
В настоящей работе мы впервые использовали для филогенетических исследований не семейства, а подсемейства SINE (B1). Было секвениро-вано большое число копий В1-элемента из грызунов, относящихся к 22 семействам. В результате чего был обнаружен целый ряд подсемейств (вариантов) B1, отличающихся специфическими
нуклеотидными заменами, дупликациями и деле-циями. Анализ распределения таких вариантов B1 среди грызунов разных семейств позволил проверить существующие схемы филогенетического родства в пределах этого отряда млекопитающих.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Образцы ДНК. Источники получения животных, их тканей или ДНК представлены в таблице. ДНК выделяли из свежих, замороженных или фиксированных в спирте тканей (почки, печень или мышцы) инкубацией гомогената с протеина-зой К и последующей депротеинизацией смесью фенола с хлороформом (1 : 1).
Дот-гибридизация. Геномные ДНК грызунов (500 нг) инкубировали в 10 мкл 0.5 М NaOH в течение одного часа при 37°C, после чего добавляли 200 мкл раствора: 6xSSC - 6%-ный формальдегид -25 мМ NaH2PO4. ДНК наносили на нейлоновый фильтр Hybond N с помощью стандартного устройства для дот-блотов. ДНК, иммобилизованную на фильтре, гибридизовали с 32Р-мечен-ным В1-зондом мыши в смеси 4 х SSC-0.5% SDS -5 х раствор Денхардта-0.1 мг/мл денатурированной ДНК сельди при 60°C [26]. Фильтр отмывали в 0.1 х SSC-0.1% SDS при 42°C. Радиоактивность, связанную с геномными ДНК, измеряли с помощью фосфоримиджера Cyclon ("Packard", США).
Конструирование библиотек и их скрининг. Геномные ДНК грызунов (1.5-5.0 мкг) обрабатывали рестриктазами EcoRI и HindIII (ДНК Eremo-dipus lichtensteini была обработана рестриктазами KpnI и HindIII, поскольку большинство копий В1-элемента тушканчиков содержат внутренний сайт EcoRI) и фракционировали в 1%-ном агароз-ном геле. Фрагменты ДНК длиной от 500 до 1200 пн переносили на ДЭАЭ-фильтр с помощью электрофореза. Затем ДНК элюировали путем инкубации фильтра в 400 мкл 1 М NaCl-10 мМ трис-HCl (pH 8.0)-1 мМ ЭДТА при 60°C в течение 30 мин. ДНК осаждали этанолом, используя 10 мкг гликогена в качестве носителя. Фрагменты ДНК (0.1-0.5 мкг) лигировали с плазмидным вектором pGEM3Z (0.1-0.3 мкг), обработанным теми же рестриктазами. Полученным лигатом трансформировали компетентные клетки E. coli XL-1 Blue. Колонии переносили на нитроцеллюлозные фильтры и гибридизовали в тех же условиях, что и при дот-гибридизации. Позитивные колонии выявляли с помощью радиоавтографии. Клоны E. coli, содержащие В1-фрагменты, очищали от загрязняющих клонов, используя два дополнительных раунда гибридизации и рассев штрихом.
Геномная ДНК C. gundi была сильно дегради-рована; поэтому после
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.