ГЕНЕТИКА, 2007, том 43, № 2, с. 245-253
УДК 577.21:5997355
ГЕНЕТИКА ЖИВОТНЫХ
РЕКОНСТРУКЦИЯ ФИЛОГЕНИИ РОДА Capra (Eovidae, Artiodactyla) НА ОСНОВАНИИ АНАЛИЗА МИТОХОНДРИАЛЬНОЙ ДНК
© 2007 г. Е. Ю. Казанская, М. В. Кузнецова, А. А. Данилкин
Институт проблем экологии и эволюции им. АН. Северцова Российской академии наук, Москва 119071;
факс: (495) 954-13-54; e-mail: cernus@yandex.ru Поступила в редакцию 21.11.2005 г. Окончательный вариант получен 26.06.2006 г.
Исследованы фрагменты митохондриального генома у представителей всех видов рода Capra (Bo-vidae, Artiodactyla). Проведен филогенетический анализ 59 последовательностей гена цитохрома b (392 пн) и 22 последовательностей вариабельного фрагмента мтДНК (402 пн). В контрольном регионе обнаружены две уникальные делеции, одна из них встречается только у C. cylindricornis (17 пн), другая объединяет C. caucasica и C. aegagrus (1 пн). Группа кавказских горных козлов распадается на две клады, причем последовательности C. caucasica обнаруживают поразительное сходство с последовательностями C. aegagrus, в то время как C. cylindricornis, видимо, длительное время эволюционировал самостоятельно. Крайне близки друг к другу C. pyrenaica и C. ibex. C. sibirica образует внешнюю группу по отношению ко всем остальным видам и, по нашим данным, является наиболее древним видом рода. Генетическая дистанция, отделяющая C. falconeri (морфологически наиболее обособленный вид рода) от других видов, напротив, невелика.
Горные козлы (род Capra) - широко распространенная в пределах Южной Палеарктики группа копытных. Предком Capra принято считать нижнеплиоценовый род Tossunnoria из Монголии [1]. Из ископаемых видов более известен C. prisca, морфологически близкий к современному безоаровому козлу C. aegagrus [2].
Классификация рода Capra - одна из наиболее трудных проблем современной систематики копытных. Разные авторы насчитывают в нем от одного до 11 видов. В нашем исследовании мы руководствовались наиболее распространенной точкой зрения о составе рода, согласно которой выделяют восемь видов [3]: безоаровый (С. aegagrus), альпийский (C. ibex), сибирский (С. sibirica), нубийский (С. nubiana), пиренейский (C. pyrenaica), вин-торогий (C. falconeri), западнокавказский (С. caucasica) и восточнокавказский (C. cylindricornis) горные козлы. Кавказских козлов (С. caucasica и C. cylindricornis) многие ученые объединяют в один вид [2, 4-7]. Эллерман и Моррисон-Скотт [8] относят к C. ibex пять видов: C. ibex, С. sibirica, С. nubiana, С. caucasica и C. pyrenaica. Хальтенорт [9] причисляет к C. ibex также и C. cylindricornis. Теория выделения сборной группы "ibex" в последнее время приобретает все большее распространение. Хорошо обособленными видами, с точки зрения систематиков, оказываются C. falconeri, С. aegagrus и C. pyrenaica, тогда как всех остальных объединяют в группировки различного состава. Некоторые авторы сближают C. falconeri, C. pyrenaica, C. cylindricornis на основании гетеронимного изгиба рогов [10]. С другой сторо-
ны, в противовес крайнему "объединительству", Лидеккер [11] выделяет нубийского (C. nubiana) и абиссинского (C. walie) козлов, а Соколов [4] -С. nubiana, С. sinaitica, С. walie. Еще большему дроблению подвергается группа кавказских козлов, в которой рассматривают до пяти видов: C. caucasica, C. cylindricornis, C. severtzowi, C. rad-dei и C. dinniki [12, 13]. Подчеркивая морфологическую обособленность винторогого козла, некоторые авторы [14] считают его отдельным подро-дом Orthaegoceros (Trouessart, 1905), а Шварц [15] даже принимает его в качестве особого рода, к роду же Capra он относит всего один вид C. ibex.
На основании гипотезы об эволюции формы рогов [15] наиболее примитивными представителями рода Capra считаются С. aegagrus, затем C. sibirica, C. ibex и C. nubiana, сохранившие ряд архаичных морфологических черт, а наиболее специализированными - C. cylindricornis и C. fal-coneri [1].
До настоящего времени систематика рода базируется почти исключительно на морфологических данных: окраске и размерах животных, морфологии рогов, пропорциях черепа. Однако все эти признаки варьируют в широких пределах, наблюдается ярко выраженная половая, возрастная, сезонная, географическая и, наконец, индивидуальная изменчивость. Для выявления диагностических морфологических признаков требуется детальный анализ огромных выборок коллекционного материала, учитывающий все уровни изменчивости. Для всех выделенных внутривидовых категорий (самки, самцы, возрастные груп-
пы) эти признаки могут быть различными и в конечном счете (при анализе достаточно большого материала), как правило, между видами по этим признакам обнаруживаются зоны перекрывания. Таким образом, однозначная диагностика становится возможной лишь для "среднестатистического" представителя каждой категории. Все эти трудности создают непреодолимые преграды для решения проблем классификации и филогении рода Capra.
Немногочисленные биохимические, цитогене-тические и молекулярные исследования пока не внесли ясности в проблему классификации рода [16-21]. В исследованиях, проведенных Манко и др. [17], были получены последовательности контрольного региона и гена цитохрома b митохон-дриальной ДНК для 34 животных, по которым было построено филогенетическое дерево. Согласно построениям, радиация рода выглядит звездообразно, т.е. расхождение всех видов рода было ранним и практически одновременным (в эволюционном масштабе времени).
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Мы провели филогенетический анализ последовательностей фрагментов гена цитохрома b и контрольного региона мтДНК у восьми видов рода Capra. ДНК выделяли из заспиртованных образцов мышечной ткани животных разного пола и возраста (от 2 до 13 лет). Экстракцию осуществляли смесью фенола и хлороформа или набором DNA Genomic Purification Kit ("Fermentas", Литва). Кроме того, одна последовательность фрагмента D-петли C. aegagrus (№ 39) получена из костного материала (коллекция ЗММГУ, коллекционный номер - S-483QQ), с помощью методики для выделения ДНК из костных и роговых тканей [22] и набора реактивов PCR Purification Kit ("Qiagen").
Для амплификации фрагмента цитохрома b использовали три праймера: GLU прямой (L14724) 5'-CGA AGC TTG ATA TGA AAA ACC ATC GTT G-3'; CB2 обратный (H15149) 5'-AAA CTG CAG CCC CTC AGA ATG ATA TTT GTC CTC A-3'; R обратный (H15915) 5'-GGA ATT CAT CTC TCC GGT TTA CAA GAC-3'.
Полимеразную цепную реакцию проводили при следующих условиях: 94°С - 3 мин (1 цикл), 94°С - 30 с, 50°С - 15 с, 72°С - 50 с или 2 мин, в зависимости от длины получаемого участка (35 циклов), 72°С - 3 мин (1 цикл).
Для амплификации левого домена контрольного региона использованы праймеры DLC и PRO, полученные для вилорога и других полорогих [23]: PRO прямой (L15376) 5'-CAC TAT CAA CAC CCA AAG CTG AAG-3'; DLC обратный (H16498) 5'-ATG GCC CTG AAG AAA GAA CAA GAT-3'
Амплификацию фрагмента проводили в следующем режиме: 94°С - 3 мин (1 цикл); 94°С -30 с, 62°С - 24 с, 72°С - 1 мин (30 циклов); 72°С -6 мин (1 цикл). Для проведения ПЦР использовали автономный амплификатор "Терцик".
Секвенирование полученного фрагмента осуществляли с помощью набора реактивов ABI PRISM® BigDye™ Terminator v. 3.1 с последующим анализом продуктов реакции на автоматическом секвенаторе ABI PRISM 310.
Выравнивание полученных нами и извлеченных из международной базы данных GenBank последовательностей проводили вручную с помощью программы BioEdit [24]. В качестве внешних групп при построении филогенетических деревьев выбраны последовательности мтДНК голубого барана (Pseudois nayaur) и горала (Nemorhae-dus goral). Для анализа последовательностей и построения филогенетических деревьев методом минимальной эволюции использована компьютерная программа MEGA3 [25]. Для построения филогенетических деревьев методом максимальной экономии (maximum parsimony, MP) использован пакет программы PAUP 4.10 [26].
Всего нами получено 33 последовательности начального фрагмента цитохрома b и еще 26 последовательностей извлечены из международной базы данных (GenBank). Длина объединенного выравнивания составила 392 пн. Для 17 образцов получена почти полная последовательность гена цитохрома b. Длина выравнивания, в котором также использованы 24 последовательности из GenBank, - 1128 пн.
Для проверки полученных данных на других участках митохондриального генома прочитано 19 последовательностей вариабельного фрагмента контрольного региона мтДНК, которые объединены в выравнивании с тремя последовательностями из GenBank. Длина выравнивания - 402 пн.
Вариабельность каждого из трех выравниваний была исследована с помощью программы MEGA 3.0 [25].
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
В первую очередь следует отметить довольно высокий уровень внутриродовой изменчивости по всем изученным участкам. Наиболее изменчив, как и предполагалось, вариабельный участок контрольного региона. Из 402 позиций выравнивания 165 содержали замены (что составляет 41%), 94 из них - информативны для анализа с помощью метода максимальной парсимонии. Среднее (округленно) количество замен на одну последовательность - 37 транзиций (12, 9, 16 замен по первой, второй и третьей позиции соответственно) и 6 (2, 2, 2) трансверсий.
1 ACCCACACAA-----------------TGCTACACGC C. cylindricornis 10 (Кабардино-Балкария)
ACCCACACGA-----------------TGCTACACGC C. cylindricornis 11 (Кабардино-Балкария)
ACCCAGACAA-----------------TGCTACACGC C. cylindricornis 7 (Кабардино-Балкария)
ACCCACACAA-----------------TGCTACACGC C. cylindricornis 9 (Кабардино-Балкария)
ACCCACACAA-----------------TGCTACACGC C. cylindricornis 42 (Кабардино-Балкария)
ACCCATATTAATGCCA - - ACCACACAATGTTACACGA C. sibirica 29 (Киргизия) ACCCACACAAACGCCAACACCACACAATGTTACACGT C. falconeri 30 (Таджикистан) ACCCACACAAACGCCAACACCACACAATGTTACGCGT C. hircus AB110575* ACCCACACAAACGCCAACACCACACAATATTACGTGT C. aegagrus AB004076* ACCCACACAAACACCAT- ACCACGCAATGTTACACGT C. aegagrus (17, 18) (Дагестан) ACCCACACAAACACCAT- ACCACGCAATGTTACACGT C. aegagrus (39) (Армения) ATCCGCACAAACGCCAT- ACCACGCAATGTTACACGT C. caucasica (5, 6, 8, 26, 53, 54, 55)
(Карачаево-Ч
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.