БИОХИМИЯ, 2006, том 71, вып. 5, с. 636 - 644
УДК 577.152.3
РЕНАТУРАЦИЯ, АКТИВАЦИЯ И ПРАКТИЧЕСКОЕ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ РЕКОМБИНАНТНОЙ ДУПЛЕКС-СПЕЦИФИЧНОЙ НУКЛЕАЗЫ КАМЧАТСКОГО КРАБА*
© 2006 г. В.Е. Анисимова, Д.В. Ребриков, П.А. Жулидов, Д.Б. Староверов, С.А. Лукьянов, А.С. Щеглов**
Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, 117997 Москва, ул. Миклухо-Маклая, 16/10; факс: (495)330-7056, электронная почта: jukart@mail.ru
Поступила в редакцию 02.11.05 После доработки 26.01.06
Исследована экспрессия ДСН в клетках Escherichia coli и разработан метод очистки, ренатурации и активации этого белка. Показана идентичность свойств природной и рекомбинантной ДСН и продемонстрирована возможность эффективного применения ренатурированной ДСН для нормализации библиотек полноразмерных кДНК.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: дуплекс-специфичная нуклеаза (ДСН), ДНК- и РНК-неспецифичные нуклеазы, ре-натурация, активация, специфичность.
Нуклеазы широко представлены в различных живых организмах и принимают участие в таких процессах, как репликация, репарация, рекомбинация (в том числе транспозиция), регуляция экспрессии генов, защита от вирусов, апоптоз, а также пищеварение [1]. На основе использования различных нуклеаз (прежде всего эндонуклеаз рестрикции) созданы широко распространенные методы молекулярного клонирования, изучения ДНК-белковых взаимодействий, определения структуры нуклеиновых кислот и др. В настоящее время известно множество типов нуклеаз — от высокоспецифичных эндонуклеаз рестрикции, атакующих строго определенные последовательности ДНК, до ДНК-и РНК-неспецифичных экзо- и эндонуклеаз, гидролизующих не только нуклеиновые кислоты, но и нуклеотиды. Поэтому поиск и изучение новых нуклеаз представляют интерес как с научной, так и с практической точек зрения.
Принятые сокращения: ДСН — дуплекс-специфичная нуклеаза; NBT — нитросиний тетразолий; BCIP — 5-бром-4-хлороиндолилфосфат; ПДИ — протеиндисульфид-изомераза, LB — среда Luria—Bertani; IPTG — изопропил-P-D-тио-галактопиранозид; GSH — глутатион восстановленный; GSSG — глутатион окисленный; Cys — цистеин; Cys-Cys — цистин; SDS — додецилсульфат натрия, PBS — стандартный фосфатно-солевой буфер, ПЭГ — полиэтилен-гликоль.
* Первоначально английский вариант рукописи был опубликован на сайте «Biochemistry» (Moscow), Papers in Press, BM 05-241, 09.04.2006.
** Адресат для корреспонденции и запросов оттисков.
Ранее в нашей лаборатории была выделена и охарактеризована новая уникальная нуклеаза (дуплекс-специфичная нуклеаза, или ДСН) из ге-патопанкреаса камчатского краба Paralithodes camtschaticus, а также был клонирован ее ген [2]. Аминокислотная последовательность этой нуклеазы позволяла отнести ее к классу ДНК- и РНК-неспецифичных эндонуклеаз. Ферменты этой группы гидролизуют связи между сахарным остатком и остатком фосфата в ДНК, РНК и нукле-отидах [1]. Однако ДСН при взаимодействии с нуклеиновыми кислотами проявляет высокую специфичность, гидролизуя только двухцепочеч-ную ДНК и цепь ДНК в ДНК-РНК-гибридах, и не проявляет активности по отношению к РНК и одноцепочечной ДНК. Кроме того, для эффективного катализа ДСН необходимо наличие как минимум десяти пар идеально комплементарных нуклеотидов в двойной спирали ДНК [2]. ДСН устойчива и активна в широком диапазоне температур. Специфичность и термостабильность позволили создать на базе этого фермента два моле-кулярно-биологических метода: нормализацию библиотек полноразмерных кДНК [3] и детекцию точечных нуклеотидных замен в геноме [2]. Однако отсутствие рекомбинантной активной ДСН ограничивало возможности ее применения, создания новых методов на ее основе и делало невозможным исследование молекулярных механизмов столь необычной специфичности фермента.
Цель данной работы — исследование экспрессии ДСН в клетках Escherichia coli и последую-
щих выделения и ренатурации фермента из тел включения.
МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Все использовавшиеся в работе неорганические соли, антибиотики и среды, а также про-теиндисульфидизомераза были произведены фирмой «Sigma-Aldrich» (ЕС). Эндонуклеазы рестрикции, Т4 ДНК-лигаза и буферы к ним поставлены фирмой «New England Biolabs» (Англия). Обратная транскриптаза (Powerscript), ДНК-полимераза (Advantage 2) и буферы к ним, поли(А)-РНК плаценты человека, а также нук-леотиды и металлоаффинная смола (TALON) были произведены фирмой «Clontech» (США). Использовались вектор pET22b(+) и штаммы E. coli XLblue и BL21(DE3) производства фирмы «Novagen» (ЕС), протеиназа К производства фирмы «Roche» (ЕС).
Клонирование и экспрессия ДСН. Из гепато-панкреаса краба была выделена суммарная РНК согласно протоколу [4]. С полученной РНК был проведен синтез первой цепи кДНК с использованием SMART cDNA Amplification Kit («Clon-tech») согласно инструкции производителя. Далее с полученной первой цепи была проведена амплификация кодирующего участка кДНК ДСН с использованием ген-специфических олигонуклео-тидов: (5'-TTGGATCCTGTCAATGGC-CAGG-ACTGTGTGTGG-3' и 5'-AAAAGCTTAG-TGAG-GAGTCCGACATTGCCCAG-3'). ПЦР-Продукт был очищен с помощью QIA-Qwick PCR purification kit («Qiagene», ЕС), а затем был обработан эндонук-леазами рестрикции BamHI и HindIII и клонирован в вектор pET22b(+). Полученная конструкция была проверена на отсутствие мутаций секвениро-ванием. Конструкцией DSN—pET22b(+) был трансформирован штамм BL21 (DE3). Трансформированные клетки выращивали на агаризован-ной среде Luria—Bertani (LB), содержавшей ампициллин в концентрации 0,2 мг/мл, в течение 14—16 ч. Единичные колонии инокулировали в 4 мл жидкой среды LB, содержавшей ампициллин, и растили при постоянном перемешивании (300 об/мин) и 37° в течение 14—16 ч. Затем 1 мл полученной клеточной суспензии разводили в 100 мл жидкой среды LB с ампициллином, содержавшей 3% этанола, и подращивали при 37° до оптического поглощения суспензии ^600 0,8—1,0. После этого добавляли IPTG до конечной концентрации 1 мМ и растили культуру при 37° в течение 5 ч.
При оптимизации условий культивирования для получения растворимой ДСН мы применяли следующие методики: культивирование штам-
ма-продуцента при 30° или комнатной температуре (проводили аналогично описанной выше процедуре, снизив температуру до комнатной или 30°); уменьшение времени после индукции (следовали основной методике, отбирая аликвоту культуры штамма-продуцента через 0,5, 1 и 2 ч после добавления IPTG); активацию собственных шаперонов штамма-продуцента (отдельные колонии инокулировали в 4 мл жидкой среды LB, содержавшей ампициллин, и растили при постоянном перемешивании (300 об/мин) и температуре 37° в течение 14—16 ч; затем 1 мл полученной клеточной суспензии разводили в 100 мл жидкой среды LB с ампициллином, содержавшей 3% этанола, и подращивали при 37° до оптического поглощения суспензии ^600 0,8—1,0; после этого добавляли IPTG до конечной концентрации 1 мМ и растили культуру при 37° в течение 5 ч).
Очистка рекомбинантного фермента. Клетки после индукции осаждали на центрифуге с охлаждением в течение 15 мин при 4000 g. Осадок клеток ресуспендировали в 50 мМ Tris-HCl-буфере, pH 8,0, и гомогенизировали ультразвуком. Полученный лизат центрифугировали при 15 000 g в течение 10 мин. Супернатант и осадок были проанализированы на содержание искомого белка методом электрофореза в ПААГ с добавлением SDS. Тела включения отмывали по следующей схеме:
осадок после предыдущей стадии ресуспен-дировали в 50 мМ Tris-HCl-буфере, pH 8,0, затем центрифугировали 15 мин при 15 000 g, процедуру повторяли 2 раза;
осадок ресуспендировали в 50 мМ Tris-HCl-буфере, pH 8,0, содержавшем 1% Triton X-100 и 0,5 М NaCl, центрифугировали 15 мин при 15 000 g, процедуру повторяли 3 раза;
осадок ресуспендировали в 50 мМ Tris-HCl-буфере, pH 8,0, содержавшем 2 М мочевину, центрифугировали при тех же условиях.
Отмытые тельца растворяли в 50 мМ Tris-HCl-буфере, pH 8,0, содержавшем 8 М мочевину. Нерастворимые частицы удаляли центрифугированием, а полученный раствор смешивали с 50%-ной суспензией TALON («Clontech»), предварительно отмытой в 0,05 М Tris-HCl-буфере, рН 8,0, содержавшем 8 М мочевину. Количество сорбента рассчитывалось исходя из соотношения 1 мл смолы на белок из 50 мл экспрессион-ной культуры. Полученную суспензию инкубировали 30 мин при перемешивании, затем центрифугировали 2 мин при 1000 g, супернатант удаляли, а осевший сорбент 5 раз промывали буфером нанесения. Элюцию осуществляли добавлением раствора 100 мМ ЭДТА в буфере нанесения. ДСН из растворимой фракции выделя-
ли аналогично, только в качестве рабочего буфера использовали раствор 0,05 М Tris-Cl-буфера, рН 8,0, не содержавшего мочевину.
Получение антисыворотки. Выделенную в денатурирующих условиях ДСН осаждали с помощью трихлоруксусной кислоты и трижды промывали ацетоном. Затем осадок ресуспенди-ровали в полном адъюванте Фрейнда. Годовалому кролику инъецировали по 1 мг ДСН 4 раза в течение трех месяцев. Затем у кролика отбирали аликвоту крови, удаляли клеточные элементы. Полученную сыворотку использовали в дальнейших экспериментах. Титр полученной сыворотки определяли Вестерн-дот-гибридизацией. На нитроцеллюлозную мембрану наносили по 1 мкл раствора, содержавшего от 0,1 до 0,001 мг/мл рекомбинантной ДСН. После высыхания мембрану инкубировали в PBS, содержавшем 5%-ное обезжиренное сухое молоко (забивка), в течение 1 ч. Затем добавляли анти-ДСН-сыворотку в разведении от 200 до 5000 раз и инкубировали в течение ночи при 4°. После этого мембрану отмывали PBS и инкубировали в течение часа в растворе забивки с антикроличьими антителами, конъюгированными со щелочной фосфата-зой. Далее мембраны отмывали и инкубировали в растворе NBT/BCIP до визуализации сигнала. Для определения специфичности полученных антител препарат нативной и рекомбинантной ДСН разделяли электрофорезом в ПААГ, переносили на нитроцеллюлозную мембрану и проводили Вестерн-гибридизацию с использованием антител к ДСН в качестве первичных с разведением 5000 раз.
Ренатурация ДСН. Метод с использованием одноступенчатого диализа. Раствор чистого реком-бинантного белка в 8 М мочевине на 50 мМ Tris-HCl, pH 8,0,
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.