РЕНТГЕНОВСКОЕ И СИНХРОТРОННОЕ
ИЗЛУЧЕНИЕ -ПУТЬ К ПОЗНАНИЮ СТРУКТУРЫ БИОМАКРОМОЛЕКУЛ
Как известно, до 80% информации об окружающем мире человек получает посредством зрения. Очевидно, что визуализация исследуемого объекта во многих случаях значительно расширяет возможности его изучения — такие подходы, в частности, использует структурная биология. Выяснение строения биомакромолекул и элементов клетки на всех уровнях ее организации, что является предметом этой науки, становится одним из основных движителей развития современной биологии в целом. Бурный прогресс последних лет в данной сфере во многом связан с достижениями в области рентгеноструктурного анализа и новых технологий, основанных на использовании синхротронного излучения. В Национальном исследовательском центре «Курчатовский институт» создана необходимая инфраструктура для осуществления самых амбициозных проектов в области структурной биологии.
Вместе с тем проведение работ на современном технологическом уровне подразумевает создание уникальных экспериментальных мегаустановок, что зачастую возможно лишь при объединении усилий нескольких стран.
В связи с этим Курчатовский институт активно участвует в международном (Германия, Россия и др.) проекте по строительству лазера на свободных электронах — с успешным его завершением ученые связывают большие надежды в области структурной биологии.
Член-корреспондент РАН Михаил КОВАЛЬЧУК, Член-корреспондент РАН Владимир ПОПОВ, Центр нано-, био-, информационных, когнитивных, социогуманитарных наук и технологий (НБИКС) НИЦ «Курчатовский институт» (Москва)
ЗАДАЧИ И МЕТОДЫ ВИЗУАЛИЗАЦИИ
Расшифровка генома человека, завершившаяся в 2003 г., знаменовала открытие новой эры в развитии наук о жизни и сделала XXI в. веком биологии. Создаются и ускоренными темпами совершенствуются высокопроизводительные методы исследования геномов, транскриптомов*, протеомов**, метабол омов***. Формируются и бурно развиваются системная биология, выросшая из биоинформатики, синтетическая биология, ставящая целью проектирование и построение новых, в том числе несуществующих в природе живых систем. Биология, ранее бывшая в основном описательной дисциплиной, все более превращается в науку количественную, приближается к таким точным отраслям знания, как химия и физика. Во многом этот прогресс связан с успехами структурной биологии — междисциплинарной области, занимающейся изучением строения белков, нуклеиновых кислот, их сложных мульти-субъединичных комплексов, клеточных органелл, мембран, элементов цитоскелета и т.п. на всех уровнях организации клетки.
Говорят, увидеть — значит понять. Визуализация, расшифровка пространственной структуры биомакромолекул позволила выяснить принципы работы
*Транскрипт — молекула РНК, образующаяся в результате транскрипции — экспрессии соответствующего гена или участка ДНК. Совокупность всех транскриптов, синтезируемая одной клеткой или их группой, называется транскриптомом. В отличие от генома, который, как правило, одинаков для всех клеток одной линии, транскриптом может сильно меняться в зависимости от условий окружающей среды (прим. ред.).
**Протеом — термин для обозначения всей совокупности белков (протеинов) организма, производимых клеткой, тканью или организмом в определенный период времени (прим. ред.).
***Метаболом — полный набор низкомолекулярных метаболитов (промежуточных и конечных продуктов обмена веществ), которые могут быть найдены как в биологических образцах, так и в единичном организме (прим. ред.).
сложных молекулярных «бионаномашин» и белковых комплексов, таких как рибосома, ответственная за «строительство» белков в клетке, АТФ-аза, обеспечивающая синтез универсального клеточного «топлива» — аденозинтрифосфата, фотосинтетические центры, играющие ведущую роль в фотосинтезе. Выяснение структурных особенностей молекул-биомишеней — практически обязательный этап при разработке новых лекарственных препаратов. Без знания пространственной структуры природных катализаторов — ферментов — невозможно понимание молекулярных механизмов действия последних и целенаправленного управления их свойствами.
В настоящее время существует множество физико-химических методов, с помощью которых исследуют те или иные особенности организации макромолекул, например, ближайшее окружение атомов металлов в молекулах белков или же специально введенных в них флуоресцентных или парамагнитных меток. Однако только некоторые из подходов позволяют выяснить общее строение объекта и детали его атомной и молекулярной структуры. К таковым в настоящее время относятся рентгеноструктурный анализ (РСА), методы малоуглового рентгеновского рассеяния (МУРР), ядерного магнитного резонанса (ЯМР) и криоэлектронная микроскопия (КЭМ).
Каждый из вышеперечисленных методов имеет не только свои преимущества, но и ограничения. Так, для рентгеноструктурного анализа требуются кристаллы макромолекул, получение которых представляет сложную самостоятельную задачу. Несмотря на значительный прогресс в применении ЯМР, дающего информацию о структуре макромолекул непосредственно в растворе, исследование данным методом крупных биомолекул пока затруднительно. Тем не менее, при совместном использовании эти подходы позволяют получить достаточно детальную инфор-
РСА (88%) ЯМР (11%)
МУРР
КЭМ (<1%)
А к
S к
S S
J X
л ф
W X
S ^
^ о
л с
1- о
ф S
ч л
Л 1-
X о
ф 1-
GQ о
о о
а а
> с
V
Ь
■ 90
ct
<в
70
а
so £
-О I
40 я
m
О
a 30 |
о
Ю I
о m
10 ^
О
Основные методы исследования пространственных структур макромолекул и статистика роста числа структур в банке данных RCSв (www.rcsb.org).
мацию даже о весьма сложно организованных биологических объектах. Например, получив на основе МУРР или КЭМ общее представление о форме и структуре предмета исследования, можно, разобрав затем его методами молекулярной биологии «на части», изучить на более тонком уровне «планировку» его отдельных фрагментов (доменов, отдельных белков) с помощью ЯМР или РСА, а потом воссоздать детали организации.
Вся информация о структурах макромолекул, полученная учеными разных стран, в настоящее время централизованно хранится в банке данных пространственных структур — Protein Data Bank (www.rcsb.org), созданном в 1971 г. в Брукхейвенской национальной лаборатории (США). Статистика показывает: начиная с середины 1990-х годов в нем наблюдается значительный рост числа структур, что связано в первую очередь с бурным развитием методической базы. На октябрь 2012 г. их здесь насчитывалось более 85000, притом что подавляющее большинство данных (88%) было получено с использованием метода РСА. Таким образом, несмотря на все ограничения и сложности, данный подход на сегодня — основа решения задач структурной биологии.
РЕНТГЕНОВСКАЯ КРИСТАЛЛОГРАФИЯ
Напомним, кристаллография — наука о свойствах кристаллов — первоначально оформилась как часть геологии и использовала в основном описательные методы (углы, огранка и т.п.) для изучения минералов. В дальнейшем, благодаря успехам химии, она перешла к исследованию их химического состава, но
только в ХХ в., в первую очередь благодаря открытию возможностей рентгеновского излучения, стала самостоятельной областью физики, а также сыграла и продолжает играть важнейшую роль в развитии современной структурной биологии.
В основе рентгеноструктурного анализа лежит явление дифракции рентгеновских лучей (открыты в 1895 г. немецким физиком Вильгельмом Рентгеном, нобелевским лауреатом 1901 г.) на трехмерной кристаллической решетке. Обнаружил это явление в 1912 г. соотечественник Рентгена Макс фон Лауэ (нобелевский лауреат 1914 г.), а теоретическое обоснование ему дали в 1913 г. британские физики Уильям Генри и Уильям Лоренс Брэгги (нобелевские лауреаты 1915 г.) и независимо в том же году — российский ученый Георгий Вульф (член-корреспондент РАН с 1921 г.).
Активно использовать для изучения макромолекул этот метод начали в 1930-1940-х годах. Первую рентгенограмму белкового кристалла (им оказался пепсин — один из протеолитических ферментов, закристаллизованный в 1929 г. американским биохимиком Джоном Нортропом) получили в 1934 г. британские ученые Джон Бернал и Дороти Ходжкин. В 1941 г. их соотечественник Уильям Эстбюри получил первую рентгенограмму ДНК. На основе рентгенограмм, выполненных британскими биофизиками Розалинд Франклин и Морисом Уилкинсом, американский биолог Джеймс Уотсон и его британский коллега Фрэнсис Крик (последние трое — нобелевские лауреаты 1962 г.) в 1953 г. предложили модель двойной спирали ДНК. А в 1958 г. под руководством английских биохимиков Макса Перутца и Джона Кендрю
Сравнение интенсивности источников рентгеновского излучения различных поколений. Расположение указанных синхротронных источников: НИЦ КИ — Россия (НИЦ «Курчатовский институт»); DESY — Германия (Deutsche Synchrotron); Spring-8 — Япония (RIKEN); ESRF — Франция (Европейская лаборатория молекулярной биологии); CLS — США (SLAC NAtional Accelerator Laboratory); XFEL — Германия (Deutsche Synchrotron, международный проект).
были расшифрованы первые структуры глобулярных белков — миоглобина и гемоглобина. Так началось стремительное продвижение рентгеноструктурного анализа в биологию.
В Советском Союзе огромный вклад в кристаллографию вообще и разработку метода рентгенострук-турного анализа в частности внес академик Борис Вайнштейн, многие годы возглавлявший Институт кристаллографии им.А.В. Шубникова АН СССР. В его лаборатории работы по кристаллографии биомакромолекул были инициированы еще в 50-х годах ХХ в., впервые получены кристаллы ряда важнейших белков и изучена их атомная структура. Под его руководством расшифрованы структуры леггемоглобина (1975 г.) — кислородсвязывающего белка растений, аспартатаминотрансферазы (1978 г.) — фермента, широко используемого в медицинской практике для лабораторной диагностики, и каталазы (1981 г.) — белка с рекордным на то время молекулярным весом более 200 000 Да. Для своего времени это были достижения высшего мирового уровня. Та же лаборатория стала одним из пионеров применения метода РСА к изуч
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.