БИОХИМИЯ, 2015, том 80, вып. 8, с. 1205 - 1214
УДК 577.0+57.037+57.04
РЕПАРАЦИЯ КЛАСТЕРНЫХ ПОВРЕЖДЕНИЙ И ДНК-ПОЛИМЕРАЗА ЙОТА*
© 2015 Е.А. Белоусова1, О.И. Лаврик12**
1 Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН, 630090Новосибирск; факс: +7(383)333-3677, электронная почта: lavrik@niboch.nsc.ru
2 Новосибирский государственный университет, 630090Новосибирск; факс: +7(383)363-4333
Поступила в редакцию 27.11.14 После доработки 30.01.15
Множественные повреждения ДНК в пределах одного или двух витков спирали — кластеры повреждений, являются источником двойных разрывов ДНК и представляют серьезную опасность для клетки. Репарация кластерных повреждений происходит в несколько этапов. Если кластер представлен повреждениями окислительного характера, то репарация индивидуального повреждения будет идти по механизму эксцизионной репарации оснований (BER), одна из стадий которого включает застройку образовавшейся после выщепле-ния поврежденного основания бреши с помощью специализированной ДНК-полимеразы. В представленной работе был исследован синтез ДНК с использованием поврежденных матриц, катализируемый ДНК-полимеразой йота. В качестве модельных ДНК были использованы два типа ДНК-субстратов: частичные ДНК-дуплексы, содержащие бреши различной длины, и ДНК-дуплексы, содержащие 5-формилурацил (5-foU) и предшественник АП-сайта — урацил — в разных цепях ДНК. Впервые показано, что ДНК-поли-мераза йота способна катализировать синтез ДНК с использованием в качестве субстратов частичных ДНК-дуплексов, содержащих бреши различной длины. Впервые показана возможность ДНК-полимеразы йота катализировать синтез ДНК в процессе репарации кластера через систему BER при использовании как неповрежденных, так и 5-&и-содержащих матриц. Продемонстрировано, что в данном случае репликатив-ный белок hPCNA (proliferating cell nuclear antigen) увеличивает эффективность синтеза ДНК, катализируемого ДНК-полимеразой йота.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: кластерные повреждения, ДНК-полимераза йота, синтез ДНК через повреждение (TLS), эксцизионная репарация оснований, окисленные основания.
Ионизирующая радиация, УФ-излучение или окислительный стресс приводят к образованию свободных радикалов в клетке; последние взаимодействуют с гетероциклическими основаниями ДНК и продуцируют большое количество повреждений, локализованных в пределах одного или двух витков спирали ДНК, т.е. кластер [1]. Подобные кластеры могут состоять из нескольких различных типов повреждений, механизм репарации которых зависит от их структуры. В частности, повреждения, вызванные действием алкилирующих агентов или активных форм кислорода, в клетках млекопитающих репарируются с помощью системы эксцизионной репарации оснований, ВЕЯ [2]. Этот процесс начинается с расщепления ^-С-гликозидной связи между поврежденным
* Первоначально английский вариант рукописи был опубликован на сайте «Biochemistry» (Moscow), Papers in Press, BM 15-323, 12.04.2015.
** Адресат для корреспонденции.
основанием и сахарофосфатным остовом специфической ДНК-гликозилазой и последующего расщепления цепи ДНК с помощью эндо-нуклеазной активности АП-эндонуклеазы [3]. Затем 5'-концевой остаток сахара (ёЯр-фраг-мент) выщепляется с помощью лиазной активности и образовавшаяся брешь застраивается ДНК-полимеразой; полученный одноцепочеч-ный разрыв сшивается с помощью ДНК-лига-зы. Следует отметить, что в случае ВЕЯ при репарации кластерного повреждения ДНК-поли-мераза вынуждена вести синтез ДНК по поврежденной матрице. В клетках млекопитающих основным ДНК-синтезирующим ферментом ВЕЯ является ДНК-полимераза бета. Она обладает невысокой точностью синтеза и имеет ёЯр-лиазную активность [4]. В то же время этот фермент способен катализировать синтез ДНК с использованием поврежденных матриц [5, 6]. В последние несколько лет было открыто большое количество новых ДНК-полимераз, функционирующих в клетках человека, в том числе
и ДНК-полимераза йота [7]. Клеточная функция этого фермента еще не установлена окончательно, однако понятно, что он обладает ДНК-полимеразной и ёЯр-лиазной активностями, что позволяет его рассматривать в качестве претендента на роль ДНК-полимеразы в процессе ВЕЯ [8]. ДНК-полимераза йота относится к структурному семейству У, члены которого задействованы в процессе синтеза ДНК через повреждение [9]. Кроме того, ДНК-поли-мераза йота демонстрирует достаточно низкую точность синтеза при копировании неповрежденных матриц, однако этот фермент способен к формированию пар оснований с использованием неканонических взаимодействий, что существенно повышает точность синтеза через повреждение. Этот факт, несомненно, дает основание предполагать возможность участия ДНК-полимеразы йота в таком сложном процессе, как репарация кластерных повреждений ДНК.
В представленной работе была исследована способность ДНК-полимеразы йота катализировать синтез ДНК в процессе эксцизионной репарации, в том числе с использованием поврежденной матрицы. В качестве модельных структур были использованы две группы ДНК-субстратов. Первую группу составляли частичные ДНК-дуплексы, содержащие бреши различной длины — 1, 2 и 5 нуклеотидных звеньев с З'-гидроксильной и 5'-фосфатной группами на концах. Вторая группа ДНК-субстратов представляла собой двуцепочечные ДНК-дуплексы с 5-формилурацилом и предшественником АП-сайта — урацилом в противоположных цепях ДНК со смещением на одно нуклеотидное звено. АП-сайт получали с помощью фермента урацил-ДНК-гликозилазы, специфически расщепляющего гликозидную связь дезоксиуриди-на в составе ДНК. Дальнейшую репарацию ДНК-субстрата проводили с использованием белков системы ВЕЯ. В качестве основного был использован кинетический подход, то есть определение величин Кт, Утак и кса1. Сравнение величин кинетических параметров, полученных при изучении репарации одиночного (АП-сайт) и кластерного (5-Юи/АП-сайт) повреждений в присутствии или в отсутствие дополнительных белковых факторов, позволяет оценить эффективность процесса репарации кластера определенного состава. Кроме того, знание кинетических характеристик позволяет судить о специфичности конкретной реакции относительно типа повреждения в составе кластера, а также о возможности участия исследуемого фермента и/или белкового фактора в процессе репарации кластера.
МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
В работе были использованы следующие материалы и реактивы: бычий сывороточный альбумин, БСА («New England Biolabs», Великобритания), Т4-полинуклеотидкиназа (5000 е.а./мл) («Биосан», Россия), [у-32Р]АТР с удельной активностью 5000 Ки/ммоль (ЛБТ ИХБФМ СО РАН), dNTP («Promega», США), немодифици-рованные и урацил-содержащие олигонуклео-тиды («GenSet», Швейцария), реактивы для электрофореза и основные компоненты буферов («Sigma», США). Остальные использованные реактивы и компоненты буферов отечественного производства имели квалификацию ос.ч. и ч.д.а.
Формильную группу тимина генерировали, как описано в [5].
hPCNA дикого типа (proliferating cell nuclear antigen) был выделен и любезно предоставлен И.О. Петрусевой (ЛБХФ ИХБФМ СО РАН). Урацил-ДНК-гликозилаза, UNG, E. coli и апури-новая/апиримидиновая эндонуклеаза 1 человека, АРЕ1, были выделены и любезно предоставлены С.Н. Ходыревой (ЛБХФ ИХБФМ СО РАН).
Рекомбинантная ДНК-полимераза йота человека была выделена из суперпродуцента клеток E. coli штамма RW644, трансформированного плазмидной ДНК pCT14, согласно методике, описанной в [10]. Плазмидная ДНК была любезно предоставлена Р. Вудгейтом и Е. Франк (Национальный институт здоровья, Роквилл, США). На С-конце рекомбинантная ДНК-по-лимераза йота содержала гистидиновый тракт, облегчающий очистку целевого белка из клеточного экстракта с помощью металл-хелатной хроматографии на Ni-NTA-агарозе. Дальнейшую очистку проводили с использованием гид-роксиапатита и катионообменной смолы. После диализа целевых фракций выход целевого белка составил 1,15 мг, выделенных из 3 л культуры E. coli.
Получение 5'-[32P]радиоактивно меченых оли-гонуклеотидов. Введение радиоактивной метки в 5'-конец олигонуклеотида проводили с помощью Т4-полинуклеотидкиназы как описано в [11]. Реакционная смесь (10 мкл) содержала 0,5 мкМ олигонуклеотид, 5 МБк [у-32Р]АТР, 5 е.а. Т4-по-линуклеотидкиназы. Реакцию проводили при 37° 30 мин, затем в реакционную смесь добавляли АТФ до конечной концентрации 1 мМ и оставляли при 4° в течение ночи. Нуклеотидный материал выделяли из соответствующего участка геля, локализованного радиоавтографией, электроэлюцией на бумагу DE-81. Электродным буфером служил 50 мМ Tris-боратный буфер, рН 8,3. Продукт элюировали с DE-81
5 порциями по 20 мкл горячего раствора 3 М LiClO4. К элюату добавляли 1,2 мл охлажденного до 4° ацетона, смесь выдерживали при —40° в течение 1 ч. Выпавший осадок собирали центрифугированием при максимальных оборотах, промывали два раза по 1 мл охлажденного до 4° ацетона, сушили на воздухе, затем растворяли до необходимой концентрации в воде. Полученные радиоактивно меченые олигонуклеоти-ды использовали для получения двуцепочечных ДНК-субстратов смешиванием растворов нескольких олигонуклеотидов в молярном соотношении 1 : 1, прогреванием смеси при 97° в течение 5 мин и последующим постепенным ступенчатым охлаждением до комнатной температуры.
АП-сайт получали непосредственно перед использованием ДНК-субстратов с помощью урацил-ДНК-гликозилазы. Реакционные смеси, содержащие в 10 мкл воды 1 пмоль двуцепочеч-ного 5'-[32Р]радиоактивно меченого урацил-со-держащего ДНК-субстрата и 0,1 е.а. UDG, инкубировали при 37° в течение 30 мин и использовали для дальнейших исследований. Полное выщепление урацила подтверждали с помощью гель-электрофореза (указано на рисунках). Все последующие реакции проводили в присутствии 0,15 мМ MgCl2 или MnCl2, а также стандартных компонентов буфера ТДБ: 50 мМ Tris-HCl, рН 8,0, 0,5 мМ ДТТ, 0,25 мг/мл БСА.
Синтез ДНК, катализируемый ДНК-полиме-разой йота, проводили следующим образом. Сначала, если это было необходимо, 5'-[32Р]ра-диоактивно меченые двуцепочечные ДНК-субстраты обрабатывали UDG, как описано выше. После этого к реакционным смесям добавляли ТДБ-буф
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.