ГЕНЕТИКА, 2007, том 43, № 1, с. 100-104
КРАТКИЕ СООБЩЕНИЯ
УДК 575.224:582.282.23
РЕПАРАЦИЯ ЦИСПЛАТИНОВЫХ АДДУКТОВ ДНК В МУТАНТАХ ПО ГЕНАМ, КОНТРОЛИРУЮЩИМ СПОНТАННЫЙ И ИНДУЦИРОВАННЫЙ МУТАГЕНЕЗ У ДРОЖЖЕЙ Saccharomyces cerevisiae
© 2007 г. С. В. Ковальцова, А. Ю. Черненков, В. Г. Королев
Петербургский институт ядерной физики им. Б.П. Константинова Российской академии наук, Ленинградская область, Гатчина 188300; факс: (81371) 323-03; e-mail: lge@omrb.pnpi.spb.ru
Поступила в редакцию 15.02.2006 г.
Изучена чувствительность к летальному действию антиканцерогенного препарата цисплатины у мутантов дрожжей himl, hsm2, hsm3 и hsm6, дефектных по репарации спонтанных и индуцированных мутаций. Мутанты himl и hsm3 показали такую же устойчивость к данному агенту, как и штамм дикого типа. Выживаемость двойного мутанта rad2 hsm3 была выше по сравнению с одиночным мутантом rad2. Мутанты hsm2 и hsm6 обнаружили большую чувствительность к цисплатине, чем дикий тип. Показан высокий мутагенный и рекомбиногенный эффект цисплатины на клетки дрожжей.
Цис-диаминодихлорплатина (цисплатина) -один из наиболее эффективных препаратов при лечении некоторых видов злокачественных опухолей. Известен механизм действия цисплатины на ДНК. Ионы хлора взаимодействуют с гидрок-сильными группами (в основном с ^-положением в пуринах) и молекула цисплатины встраивается в ДНК, связывая соседние пурины одной цепи (около 80% всех повреждений) или обеих нитей ДНК, образуя внутри- и межнитевые сшивки, или диаддукты. Происходящие при этом изменения конформации спирали ДНК являются сигналом для опознавания репарационными системами клетки [1]. Репарация цисплатиновых аддуктов активно изучается как на клетках млекопитающих, так и на клетках модельных микробных организмов, таких как Escherichia coli и Saccharomyces cerevisiae. Показано, что нуклео-тид-эксцизионная репарация (NER) удаляет повреждения, индуцированные цисплатиной, а мутанты дрожжей radl, rad14, rad3, несущие мутации по этому пути репарации, чувствительны к данному агенту [2, 3]. Гены MEC1, MEC3, RAD53, участвующие в контроле клеточного цикла, также влияют на эффективность репарации цисплатиновых аддуктов [2]. В репарации этих повреждений ДНК принимают участие также белки HMG (белки высокомобильной группы хроматина), которые способны связываться с цисплати-новыми аддуктами [4]. Мутанты по генам IXR1 (у почкующихся) и CMB1 (у делящихся дрожжей), кодирующим HMG-белки, чувствительны к цито-токсическому действию цисплатины [5, 6]. Показано также участие пострепликативной (ген RAD6) и рекомбинационной (гены RAD51, RAD52) репарации в удалении аддуктов, индуцированных цис-
платиной [2, 3, 7]. И наконец, белки мисматч-ре-парации, опознающие ошибочно спаренные нук-леотиды, могут связываться с цисплатиновыми аддуктами [8]. Однако это связывание не приводит к удалению повреждений, но дефектность по мисматч-репарации повышает резистентность клеток различных организмов к цитостатическо-му действию цисплатины [9, 10].
Цель данной работы - изучение чувствительности к летальному действию цисплатины мутантов почкующихся дрожжей himl, hsm2, hsm3 и hsm6, дефектных по минорным путям мисматч-репарации, а также оценка рекомбиногенного и мутагенного эффектов цисплатины на материале высокочувствительных тестерных штаммов дрожжей.
Штаммы. Генотипы использованных в работе штаммов приведены в табл. 1.
Питательные среды. Для учета выживаемости использовали среду D, для учета сегрегации и кроссинговера - специальную среду. Составы этих сред описаны в [16]. Для учета мутагенеза применяли среду со спиртом, состав которой описан в сообщении [17].
Воздействие цисплатиной. В экспериментах использовали цисплатину Pt(NH3)Cl2-cis-platinum(II) diaminedichloride (производство компании "Sigma"). Водную суспензию клеток 3-4-дневной культуры в стационарной фазе роста смешивали с раствором цисплатины. Конечные концентрации цисплатины были: 2.5, 1.2, 0.6, 0.3, 0.15 и 0.07 мМ. Воздействие продолжалось 90 мин при t = 30°C при постоянном перемешивании. Действие цисплатины снимали 100-кратным разведением водой и обработанную суспензию после разведения
Таблица 1. Штаммы дрожжей Saccharomyces cerevisiae, использованные в работе
Штамм Генотип Литературный источник
11D-3031* MATa ade2-A248 leu2-3,112 ura3-160,188 trpl [11]
10-SYA-3031* MATa ade2-A248 leu2-3,112 ura3-160,188 trpl HIM1 : :URA3 [12]
5-LMG-3031* MATa ade2-A248 leu2-3,112 ura3-160,188 trp1 HSM3 : :KanR [12]
35-LMG-3031* MATa ade2-A248 leu2-3,112 ura3-160,188 trp1 RAD2 : :TRP1 [12]
16-LMG-3031* MATa ade2-A248 leu2-3,112 ura3-160,188 trp1 RAD2 : :TRP1 HSM3 :: KanR [13]
8-SVK-326** MATa ade2-A248 leu2-3,112 ura3-160,188 trp1 hsm2-1 [14]
14-SVK-316** MATa ade2-A248 ura3-160,188 trp1 hsm6-1 [11]
ПГ-155 MATa ade2-192 rad2-1/MATa ade2-G45 rad2-1 [15]
* Изогенные штаммы. ** Близкородственные штаммы.
высевали на чашки Петри. Поставлено не менее пяти повторностей каждого эксперимента. На рисунке приведены средние значения выживаемости со стандартными отклонениями.
Мутанты hsm2, hsm3 и hsm6 были выделены по признаку повышенного спонтанного мутагенеза [18]; мутант himl - по признаку повышенного мутагенеза, индуцированного азотистой кислотой [12]. Все перечисленные мутанты показали также повышенный мутагенез под действием ряда мутагенов, таких как УФ-лучи, азотистая кислота, этилметансульфонат, метилметансульфонат и оксиаминопурин. Дефекты репарации у этих мутантов были специфически связаны с мутагенезом, так как чувствительность к летальному действию перечисленных мутагенов не была изменена у мутантов по сравнению с клетками дикого типа. На основании анализа генетических свойств этих мутантов было высказано предположение, что у них блокированы этапы минорных путей мисматч-репарации, отличных от классического Msh2-зависимого пути [18].
На рисунке приведены кривые зависимости выживаемости от дозы мутагена, полученные для изучаемых штаммов дрожжей. Мутанты по генам HIM1 и HSM3 не отличались по чувствительности от клеток дикого типа. Ген HIM1 кодирует белок (рамка YDR317w) с неизвестной функцией, гомологи которого встречаются только у грибов [12]. Ген HSM3 кодирует белок (рамка YBR271c), имеющий гомологию с Msh-белками, при этом точечный мутант по этому гену дефектен по коррекции некоторых типов искусственных гетеро-дуплексов [19]. Известно, что мутанты E. coli mutS и mutL устойчивы к цисплатине [20]. Более устойчивыми к действию цисплатины являются также мутанты по мисматч-репарации у дрожжей [10]. Как видно из рисунка, введение в генотип клетки одновременно hsm3 и rad2 мутаций делает двойной мутант достоверно более устойчивым к летальному действию цисплатины по сравнению с
одиночным rad2--мутантом. Подобное увеличение устойчивости к обработке цисплатиной наблюдали у двойных мутантов dam mutL и dam mutS E. coli по сравнению с одиночным dam-мутантом [9].
Выживаемость, %
Концентрация цисплатины, мМ
Чувствительность к летальному действию цисплатины штамма дикого типа, мутантов Ыт1, hsm2, hsm3, hsm6, rad2 и двойного мутанта rad2 hsm3 дрожжей Saccharomyces cerevisiae. • - дикий тип (11Д-3031); ▲ -ЫШ (10^А-3031); ♦ - hsm2 (8^УК-326); ■ - hsm3 (5-ЬМв-3031); ▼ - hsm6 (14^УК-316); ► - rad2 (35-ЬМв-3031), < - rad2 hsm3 (16-ЬМв-3031).
102 КОВАЛЬЦОВА и др.
Таблица 2. Мутагенный и рекомбиногенный эффекты цисплатины
Штамм 16-ЬМ0-3031 Штамм ПГ-155
Доза, мМ Частота мутаций, Х10-4 Выживаемость, % Частота конверсии,% Частота кроссинговера,% Выживаемость, %
0 0 100 0.33 0.02 100
0.01 0.76 0.23
0.03 3.1 ± 0.7 1.4 ± 0.3 61 ± 9.0
0.07 4.6 ± 0.8 2.1 ± 0.4 33.4 ± 0.5
0.15 64.9 ± 7.3 11.6 ± 1.5 6.7 ± 3.5 2.8 ± 0.7 15.2 ± 2.5
0.30 70.5 ± 6.0 3.1 ± 0.4
0.60 131 ± 15.0 1.8 ± 0.2
Предполагается, что, хотя MutS-подобные белки распознают и связываются с цисплатиновыми ад-дуктами, тем не менее репарации повреждения не происходит. В то же время образовавшийся на повреждении комплекс ДНК-белок препятствует эффективной работе репарационных систем, удаляющих аддукты цисплатины [1].
Ген ШМ2 аллелен гену НМ01, продукт которого является членом группы HMG-белков (высокомобильная группа белков хроматина) [14]. Белки этой группы связываются с аддуктами, индуцированными в ДНК цисплатиной, и мутанты по генам IXR1 и СМВ1, кодирующим HMG-белки у почкующихся и делящихся дрожжей (соответственно), чувствительны к летальному действию цисплатины [5, 6]. В наших опытах мутант hsm2 также показал чувствительность к этому веществу (рисунок).
Ген HSM6 является аллелем гена POL12, который кодирует субъединицу в альфа-полимераза-праймазного комплекса (неопубликованные данные). Результаты, представленные на рисунке, свидетельствуют, что мутант hsm6-1 более чувствителен к цисплатине по сравнению с клетками дикого типа. Это означает, что альфа-полимера-за-праймазный комплекс принимает участие в репарации повреждений, индуцированных цисплатиной.
Если цитотоксический эффект цисплатины на различные организмы исследован достаточно полно, то другие генетические эффекты этого агента мало изучены. На дрожжах S. cerevisiae показано, что цисплатина индуцирует мутации в клетках дикого типа с большей частотой, чем в мутантах по гену MSH2 [10]. Молекулярная природа мутаций в гене САЫ1, возникающих под действием цисплатины, одинакова в обоих типах клеток и возникают они в сайтах внутринитевых сшивок. Нами использован штамм дрожжей 16-LMG-3031 (rad2 hsm3) для выявления мутагенного эффекта цисплатины. Как видно из рисунка, клетки этого штамма высокочувствительны к ле-
тальному действию цисплатины. Мутация hsm3 повышает чувствительность клеток к мутагенному действию различных агентов [19]. Мутагенный эффект оценивали по возникновению прямых мутаций в пяти различных генах, контролирующих биосинтез аденина. Из данных табл. 2 следует, что цисплатина в использованном диапазоне доз снижала выживаемость гаплоидных клеток мутанта rad2 от 11.6 до 1.8%, а диплоидного штамма, гомозиготного по этой мутации, - от 61 до 15.2%. При этом мутации в гаплоидном штамме возникали с высокой частотой. Этот уровень мутагенеза сравним
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.