МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ, 2003, том 37, № 4, с. 563-572
ОБЗОРЫ =
УДК 547.963.057:577.325
РЕПЛИКАТИВНЫЙ КОМПЛЕКС ЭУКАРИОТ И ЕГО ИССЛЕДОВАНИЕ С ПОМОЩЬЮ АФФИННОЙ МОДИФИКАЦИИ
© 2003 г. О. И. Лаврик*, Д. Ю. Хлиманков, С. Н. Ходырева
Новосибирский институт биоорганической химии Сибирского отделения Российской академии наук,
Новосибирск, 630090 Поступила в редакцию 07.12.2002 г.
Репликация эукариотической ДНК осуществляется комплексом белков, в котором центральная роль принадлежит ДНК-полимеразам. Эукариотические ДНК-полимеразы а, 5 и е осуществляют репликативный синтез ДНК при участии белковых факторов репликации: репликативного белка А, репликативного белка С, ядерного антигена пролиферирующих клеток и других белков. Известно, что репликативные ДНК-полимеразы и белковые факторы также принимают участие в репарации ДНК и эти процессы взаимозависимы. Функционирование такой многокомпонентной системы регулируется совокупностью белок-нуклеиновых и белок-белковых взаимодействий. Репликативный комплекс эукариот не выделен в виде устойчивой надмолекулярной структуры, что указывает на динамичность его структурной организации. В связи с этим рентгеноструктурный анализ и другие инструментальные подходы малопригодны для исследования этой системы. Одним из альтернативных методов изучения надмолекулярных структур репликации ДНК является метод аффинной модификации. Наиболее перспективный вариант этого подхода состоит в создании in situ фотореакцион-носпособных интермедиатов репликации ДНК. В данном обзоре рассмотрены последние достижения в применении фотоаффинной модификации в исследовании ДНК-полимераз и факторов эукариотической репликации и их взаимодействия с интермедиатами эукариотической репликации ДНК.
Ключевые слова: репликация и репарация ДНК, белок-нуклеиновые взаимодействия, фотоаффинная модификация.
Генетическая стабильность живых организмов в значительной степени определяется функционированием комплекса белков, осуществляющих репликацию ДНК. Геномная ДНК синтезируется ДНК-полимеразами при участии белковых факторов, обеспечивающих взаимодействие ДНК-поли-мераз с ДНК и процессивность синтеза ДНК. Для описания одновременного синтеза обеих цепей ДНК у высших эукариот предложена модель реп-ликативной вилки (рис. 1). Согласно этой модели, на стадии инициации происходит расплетание двойной спирали ДНК с помощью ДНК-геликазы и репликативного белка A. Затем ДНК-полиме-раза ■ а-праймаза синтезирует РНК-праймеры, которые являются затравками для синтеза РНК-ДНК-праймеров. Таким образом, ДНК-полиме-раза а (Pola) в комплексе c расплетенной ДНК выполняет две функции: синтез РНК-ДНК-затравок на лидирующей цепи ДНК и параллельный синтез коротких РНК-ДНК-праймеров (предше-
Принятые сокращения: RPA - репликативный белок A; RFC - репликативный белок С; Pola - ДНК-полимераза а; Poip - ДНК-полимераза в; PolS - ДНК-полимераза 8; Pole - ДНК-полимераза £; FEN-1 - флэп-эндонуклеаза-1; PCNA - ядерный антиген пролиферирующих клеток; PARP-1 - поли-(АБР-рибозо)-полимераза-1; н. - нуклео-тид, РСА - рентгеноструктурный анализ. * Эл. почта: lavrik@niboch.nsc.ru
ственников фрагментов Оказаки) на отстающей цепи. Далее происходит замена Pola на комплекс белков, состоящий из PCNA, RFC и ДНК-полимеразы 5 (PolS), который синтезирует обе цепи ДНК [1]. В репликации ДНК эукариот участвует также ДНК-полимераза £ (Pole), способная вести PC-NA/RFC зависимый синтез ДНК в физиологических условиях.
На отстающей цепи продукты синтеза ДНК дискретны, а оставшиеся РНК-затравки удаляются до завершения реакции. В этот каскад превращений кроме Pol5 вовлечены также РНКаза Н, ДНК-лигаза I и флэп-эндонуклеаза-1. Недавние исследования показали, что FEN-1 физически взаимодействует с PCNA, который стимулирует ее нуклеазную активность в сотни раз [2]. Предполагается, что созревание фрагментов Оказаки осуществляется при согласованном действии Pol5, PCNA, FEN-1 и RPA [3]. ДНК-лигаза I - один из компонентов, необходимых для соединения фрагментов Оказаки. Показано, что этот фермент также взаимодействует с PCNA и влияет на PCNA-зависимый синтез ДНК Pol5 и Pole. Согласно одной из гипотез, PCNA может быть задействован в репликативной вилке как связующее звено между ДНК-полимеразами и другими факторами для координации процессов элонгации и
RPA
Отстающая цепь
Pol а-прйамаза
Рис. 1. Гипотетическая модель эукариотической репликативной вилки с расположенными в ней несколькими ДНК-полимеразами [1]. 1 - RFC; 2 - PCNA; 3 - комплекс Pol 8(e); 4 - RPA; 5 - геликаза; 6 - Pola-праймаза; 7 - РНК-ДНК-праймер.
процессинга отстающей цепи [2]. Согласно другой гипотезе, важнейшим фактором, координирующим действие всех других белков при переключении синтеза ДНК от одной ДНК-полимера-зы к другой, равно как и завершение синтеза, является репликативный белок А [4].
Очевидно, что репликация ДНК регулируется множеством белок-белковых и ДНК-белковых взаимодействий, механизм которых остается неизвестным. В последнее время открыты новые эукариотические ДНК-полимеразы, роль которых в репликативном комплексе еще не определена [5]. В связи с этим вероятна основательная ревизия ансамблей белков, обеспечивающих репликацию. Кроме того, комплекс репликации ДНК работает взаимосогласованно с ансамблями белков, осуществляющих репарацию повреждений ДНК, следовательно, надмолекулярная машина, метаболизирующая геномную ДнК и осуществляющая стабильное воспроизведение ее структуры, выглядит еще более сложно. Ввиду сложности и динамичности репликативного комплекса его исследование методом рентгеноструктурного анализа (РСА) и другими инструментальными подходами имеет определенные ограничения, поэтому развитие и использование альтернативных подходов представляется безусловно актуальным.
Это обстоятельство обеспечило широкое использование для изучения надмолекулярных структур методов направленной химической модификации. Один из наиболее перспективных подходов
состоит в создании in situ фотоактивных интерме-диатов репликации ДНК. Конструируются структуры ДНК, которые могут рассматриваться как интермедиаты репликации. Эти структуры содержат радиоактивную метку для последующей детекции продуктов ковалентного присоединения ДНК к белкам. Затем в специфические позиции ДНК вводятся фотореакционноспособные нукле-отиды, что может быть осуществлено, например, с помощью активности ДНК-полимераз in situ. В качестве субстратов ДНК-полимераз используются реакционноспособные аналоги dNTP, содержащие фотоактивные группы, введенные в основание. Для развития этого метода были синтезированы и охарактеризованы ряды аналогов dCTP и dUTP, содержащие различные фотореакционноспособные группы, присоединенные к основаниям линкерами различной длины [6-9]. Структуры аналогов dNTP показаны на рис. 2. Субстратные характеристики аналогов dNTP детально охарактеризованы в реакциях, катализируемых ДНК-полимеразой в (PoiP) [10, 11], обратной транскриптазой вируса иммунодефицита человека [8, 11—13], ДНК-полимеразой Thermus thermophilus [9, 14]. Аналоги также являются эффективными субстратами Pola [15] и других репликативных ДНК-полимераз [16]. Следовательно, фотореакционноспособные остатки dNMP потенциально могут быть введены в ДНК в ходе любых ее превращений. Получение фотоактивных ДНК возможно в системе, реконструированой из очищенных компонентов репликативного и репара-
РЕПЛИКАТИВНЫИ КОМПЛЕКС ЭУКАРИОТ И ЕГО ИССЛЕДОВАНИЕ R
PPP-
/ NH
N' O^N
м
OH H
R =
O F
O NO2
F N3
F
FABdCTP
NABdCTP
j^hvy
4
FABCdCTP
F N3
F
O
F N3
FABOdCTP
H N
ON
N3
FABGdCTP
PPP —
O
HN O^N
.O h H
HH-hh
OH H
O
л
O
(CH2)n
n = 0 FAB-4-dUTP n = 3 FAB-9-dUTP n = 5 FAB-11-dUTP n = 7 FAB-13-dUTP
F N3
Рис. 2. Структурные формулы реагентов для фотоаффинной модификации белков репликативной системы. FABdCTP — экзо-^[азидотетрафторбензоиламино)этил]-2'-дезоксицитидин-5'-трифосфат; NABdCTP — экзо^-[2-(2-нитро-5- ази-добензоиламино)этил]-2'-дезоксицитидин-5'-трифосфат; FABCdCTP — экзо^-[2-(4-азидотетрафторбензилиденами-нооксиметилкарбамоил)этил]-2'-дезоксицитидин-5'-трифосфат; FABOdCTP — экзо-^[4-(4-азидотетрафторбензили-денаминоокси)бутилокси]-2'-дезоксицитидин-5'-трифосфат; FABGdCTP — экзо-^[4-(4-азидотетрафторбензилиденги-дразинокарбониламиноокси)бутилкарбамоил]-2'-дезоксицитидин-5'-трифосфат; FAB-4-dUTP — 5-[транс-^(2.3,5.6-тетрафтор-4-азидобензоил)-3-аминопропенил]-2'-дезоксиуридин-5'-трифосфат; FAB-9-dUTP — 5-[транс-^(№-(2.3,5.6-тетрафтор-4-азидобензоил)-4-аминобутирил)-3-аминопропенил-1]-2'-дезоксиуридин-5'-трифосфат; FAB-11-dUTP — 5-[транс^-(№-(2.3,5.6-тетрафтор-4-азидобензоил)-4-аминогексаноил)-3-аминопропенил-1]-2'-дезоксиуридин-5'-трифо-сфат; FAB-13-dUTP — 5-^-(№-(2.3,5.6-тетрафтор-4-азидобензоил)-4-аминооктаноил)-транс-3-аминопропенил-1]-2'-дезоксиуридин-5'-трифосфат.
тивного комплекса. Кроме того, фотореакцион-носпособные интермедиаты ДНК могут быть созданы в клеточных и ядерных экстрактах. Последующее УФ-облучение приводит к формированию ковалентных аддуктов белков с ДНК. Эти аддукты могут быть обогащены хроматогра-фически, а затем разделены электрофоретичес-ки, в том числе двумерным гель-электрофорезом с последующей идентификацией белков с помощью масс-спектрометрии МЛЬБ1. Потенциально это позволит описать ансамбли белков репликации ДНК и, возможно, идентифицировать новые белки - участники процесса репликации.
Фотореакционноспособные ДНК, синтезируемые in situ, были использованы для аффинного ме-чения активных центров Pola [15], Poip [6, 10, 11] и обратной транскриптазы вируса иммунодефицита человека [11—13]. Предложенный подход выглядит наиболее перспективным в исследовании комплексов различных белков, а также белков, состоящих из нескольких субъединиц.
Одним из ключевых факторов эукариотичес-кой репликации является репликативный белок А. Этот белок состоит из полипептидов с молекулярной массой 70 (p70), 32 (p32) и 14 кДа (p14), т.е. является гетеротримером. RPA известен как фактор, связывающий однонитевую ДНК. Константа
F
F
F
F
F
диссоциации комплексов RPA с однонитевой ДНК составляет 10-9-10-11 М, в то время как сродство RPA к дву
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.