БИОЛОГИЯ ВНУТРЕННИХ ВОД, 2009, № 3, с. 105-110
ВОДНАЯ ^^^^^^^^^^^^^^ ТОКСИКОЛОГИЯ
УДК 595.324.2:577.15+574.64
РЕПРОДУКТИВНЫЕ ПОКАЗАТЕЛИ, РАЗМЕРЫ И АКТИВНОСТЬ ГИДРОЛАЗ У Daphnia magna Straus В РЯДУ ПОКОЛЕНИЙ ПРИ ДЕЙСТВИИ ГЕРБИЦИДА "РАУНДАП"
© 2009 г. Г. А. Папченкова, И. Л. Голованова, Н. В. Ушакова
Институт биологии внутренних вод им. И.Д. Папанина РАН, 152742 пос. Борок, Ярославская обл., Некоузский р-н, e-mail: golovan@ibiw.yaroslavl.ru Поступила в редакцию 24.12.2007 г.
Исследовано влияние сублетальных концентраций "Раундапа" 25.0 и 50.0 мг/л (в пересчете на гли-фосат) в ряду поколений Daphnia magna Straus. Определены эффекты по показателям плодовитости, качества потомства, линейным размерам дафний, а также активности карбогидраз и протеиназ. Отмечено влияние токсиканта как на родительские особи, так и на особи последующих поколений. В ряду четырех поколений не удалось выявить адаптацию D. magna к Раундапу, но отмечено существенное снижение резистентности к гербициду в четвертом поколении дафний по сравнению с материнской линией.
Ключевые слова: Daphnia magna, репродукция, пищеварение, ферменты, "Раундап".
ВВЕДЕНИЕ
Среди экотоксикологических факторов, влияющих на функционирование водных экосистем, важная роль принадлежит ксенобиотикам, количество которых увеличивается с ростом уровня антропогенного загрязнения. Высокотехнологичный системный гербицид широкого спектра действия гли-фосат используется в мире с середины 70-х годов прошлого века. На основе его действующего вещества изопропиламиновой соли глифосата создано много гербицидов, самый известный из них - "Раундап". Он предназначен для борьбы с сорняками в паровых полях, садах и виноградниках, в лесном хозяйстве, на промышленных объектах и на приусадебных участках. В силу повсеместного применения глифосатсодержащих гербицидов и возможности их попадания в водные экосистемы необходимо изучение их токсического действия на жизнедеятельность гидробионтов. Литературные данные по исследованию токсичности глифосата касаются в основном оценки острой токсичности [15, 20] и хронического влияния низких сублетальных концентраций гербицида на Daphnia magna Straus [8]. При этом вопросы адаптации к действию глифосата рассматриваются применительно главным образом к растениям и почвенным микроорганизмам [14, 17]. Действие же сублетальных концентраций Раундапа на жизнедеятельность ракообразных не изучено. Выбор D. magna в качестве тест-объекта обусловлен тем, что эти рачки - важное трофическое звено водных экосистем, легко культивируют-
ся, отличаются высокой скоростью воспроизводства и чувствительностью к токсикантам.
Цель работы - изучение влияния Раундапа в заведомо установленной сублетальной концентрации на репродуктивные показатели, размеры и активность карбогидраз и протеиназ у D. magm в ряду поколений.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Эксперимент выполняли на культуре D. magna, размножающейся в лабораторных условиях партеногенезом. Культуру непрерывно поддерживали в 1.5-литровых аквариумах с дехлорированной водопроводной водой при температуре 22-25°C. Летальное действие Раундапа определяли в острых опытах при экспозиции 96 ч и рассчитывали средние летальные концентрации (LC50). Сублетальные эффекты токсического действия выявляли в 15-суточном тесте, который выбран как оптимальный для решения поставленных задач, поскольку за это время рачок развивался до половозрелой особи и давал два-четыре выводка. Молодь из третьего выводка использовали для запуска линии следующего поколения, которое также тестировали на действие тех же концентраций токсиканта в аналогичных условиях. Генетически однородных рачков, возраст которых <24 ч (нулевое поколение), рассаживали в стаканы объемом 250 мл с 125 мл среды по 1 шт. в каждый (10 повторностей для каждой концентрации токсиканта и контроля). Биотестирование проводили по методике [9]. В
контроле использовали отстоянную водопроводную воду, насыщенную кислородом. На такой же воде готовили растворы Раундапа в сублетальных концентрациях 25 и 50 мг/л (в пересчете на глифо-сат). Среду обновляли через каждые 5 сут, поскольку глифосат устойчив в водном растворе и период его полураспада 2 нед [15]. Рачков ежедневно кормили суспензией клеток водоросли Chlorella vulgaris Beyer., культура которой поддерживается в лаборатории. Один раз в сутки в одно и то же время контролировали наличие помета, пересчитывали народившуюся молодь, выборочно определяли ее длину. Измерения проводили под бинокулярным микроскопом при увеличении х8. Длину тела измеряли от вершины головы до основания хвостовой иглы. На 15-е сутки эксперимента определяли длину взрослых самок. Всего проанализировано четыре поколения, в том числе родительское (первое), отличающееся от последующих поколений тем, что особи его не подвергались действию токсиканта на стадиях оогенеза и эмбриогенеза. После завершения эксперимента подсчитывали в каждом поколении суммарную плодовитость на одну самку за 15 сут эксперимента, число пометов на одну самку за 15 сут и количество новорожденных в одном вымете.
Для приготовления растворов токсиканта использовали коммерческий препарат гербицида, имеющий торговое название "Раундап" (Монсан-то, США). Средство представляет собой 36%-ный водный раствор глифосата. Возможные инертные ингредиенты, усиливающие действие активного элемента или облегчающие использование гербицида, неизвестны.
Для определения ферментативной активности в целом организме дафний c помощью стеклянного гомогенизатора готовили суммарные гомогенаты из нескольких сотен рачков, добавляя охлажденный до 2-4°С раствор Рингера для холоднокровных животных (110 ммоль NaCl, 1.9 ммоль KCl, 1.3 ммоль CaCl2, pH 7.4) в соотношении 1 : 9. Затем исходный гомогенат дополнительно разводили раствором Рингера в 2-10 раз. Растворы субстратов (растворимый крахмал в концентрации 1.8%, раствор сахарозы в концентрации 50 ммоль/л и 1%-ный раствор казеина) готовили на таком же растворе Рингера. Инкубацию гомогената и субстрата проводили в течение 30-60 мин при температуре 20°С, рН 7.4.
Активность карбогидраз (общую амилолитиче-скую активность (ОАА), отражающую суммарную активность а-амилазы КФ 3.2.1.1, глюкоами-лазы КФ 3.2.1.3 и ферментов группы мальтаз КФ 3.2.1.20, и активность сахаразы КФ 3.2.1.48) оценивали по приросту гексоз модифицированным методом Нельсона [10]. Общую протеолитическую активность (ОПА), отражающую суммарную активность трипсина, КФ 3.4.21.4, химотрипсина,
КФ 3.4.21.1 и различных пептидаз, определяли по приросту тирозина методом Ансона [13] в некоторой модификации. Ферментативную активность в каждой точке определяли в пяти повторностях с учетом фона и выражали в микромолях продуктов реакции, образующихся за 1 мин инкубации фер-ментативно активного препарата и субстрата в расчете на 1 г влажной массы ткани (мкмоль /(г ■ мин)).
Результаты представлены в виде средних и их ошибок (M ± m). При парном сравнении результатов достоверность различий оценивали по критерию Стьюдента, при множественном сравнении использовали дисперсионный анализ (ANOVA, LSD-тест), р < 0.05.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Анализ результатов эксперимента по экспонированию D. magna в растворе гербицида Раундап показал, что токсикант в концентрации 25 и 50 мг/л угнетающе действовал на рачков уже первого поколения, полученных от неэкспонированных в токсиканте на стадиях оогенеза и эмбриогенеза материнских организмов (табл. 1). Плодовитость особей материнского поколения (I), экспонируемых в токсиканте, достоверно ниже плодовитости контрольных. Плодовитость экспонируемых в гербициде особей следующих поколений (II—IV), полученных от уже экспонированных в гербициде материнских особей, также достоверно ниже плодовитости контрольных. Подобное происходило и с другим показателем репродукции - средним числом новорожденных в одном выводке. Оно достоверно снижалось во всех поколениях содержавшихся в токсиканте рачков по сравнению с контрольными и варьировало от 13 до 30 особей. Количество пометов, полученное за 15 сут эксперимента в каждом поколении, за редким исключением, также сохраняло подобную закономерность. В каждом поколении за время 15-суточного теста получено два-четыре (чаще три) выводка новорожденных. Средние величины числа суток до первого вымета потомства рачков в опытных и контрольном вариантах по поколениям представлены на рис. 1. Как правило, первый вымет особей, экспонируемых в гербициде, происходил позднее, чем в контроле. Зависимость сроков появления первого выводка от концентрации токсиканта не выявлена.
Обращает на себя внимание более высокая по сравнению с предыдущими поколениями плодовитость четвертого поколения как экспонируемых в гербициде, так и контрольных особей (табл. 1). Вероятной причиной этого могло быть влияние сезонных особенностей жизнедеятельности культуры - эксперимент с четвертым поколением пришелся на вторую половину мая, когда начинается активное размножение рачков в природе. Подобный эффект наблюдали и в ранее проведенном эксперименте с умеренными сублетальными
Таблица 1. Плодовитость рачков Daphnia magna в ряду поколений при экспозиции в растворе гербицида Раундап
Концентрация глифосата, (мг/л) Поколения
I II III IV
Суммарное количество новорожденных на одну самку за 15 сут
0 (контроль) 80.3 ± 2.8а 87.8 ± 6.4а 92.1 ± 5.8а 111.3 ± 10.6а
25 66.3 ± 5.8б 55.7 ± 7.5б 43.0 ± 3.5б 96.4 ± 6.9а
50 46.0 ± 7.0с 31.6 ± 3.2с 52.0 ± 5.4б 81.0 ± 5.1б
Количество пометов за 15 сут
0 (контроль) 3.0 ± 0.0а 3.0 ± 0.2а 3.5 ± 0.2а 3.7 ± 0.3а
25 3.3 ± 0.2а 2.7 ± 0.2а 2.4 ± 0.2б 3.7 ± 0.2а
50 2.6 ± 0.2б 2.4 ± 0.2б 2.9 ± 0.2б 4.0 ± 0.2а
Количество новорожденных в одном помете
0 (контроль) 26.8 ± 0.9а 29.4 ± 1.8а 26.2 ± 0.9а 30.4 ± 1.8а
25 20.0 ± 1.3б 20.7 ± 2.8б 18.4 ± 1.7б 25.8 ± 1.1а
50 17.1 ± 2.1б 13.2 ± 1.1с 17.8 ± 1.5б 20.2 ± 0.9б
Примечание. Здесь и в табл. 2 значения показателей с разными индексами в одном столбце достоверно различаются между собой при р < 0.05.
(0.02-2.0 мг/л в пересчете на глифосат) концентрациями Раундапа [8].
Линейные размеры тела молоди третьего вывод
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.