БИОЛОГИЯ МОРЯ, 2014, там 40, № 1, с. 46-56
УДК 595.141+591.481 ЗООЛОГИЯ БЕСПОЗВОНОЧНЫХ
РЕСНИЧНЫЕ И НЕРВНЫЕ ЭЛЕМЕНТЫ У ЮВЕНИЛЬНЫХ САМОК АННЕЛИДЫ DINOPHIL US GYROCILIATUS (О. SCHMIDT, 1848) (ANNELIDA: POLYCHAETA)1
© 2014 г. Е. Г. Фофанова, Л. П. Незлин, Е. Е. Воронежская
Институт биологииразвития -им. Н.К. Кольцова РАН,Москеа 119334 e-mail: lizchenbio@mail.ru
Статья принята к печати 6.06.2013 г.
У ювенильных самок Dinophilus gyrociliatus (О. Schmidt, 1848) исследовали ресничные и нервные элементы после иммуномечения антителами к тубулину, серотонину и FMRFамиду. С помощью антител к тубулину на поверхности тела животных выявлены два головных и семь туловищных ресничных шнуров, головные ресничные поля и вентральная ресничная полоска. Внутри тела обнаружены реснички пищеварительного канала и пять пар протонефридиев. Установлено, что нервная система представлена головным нейропилем с отходящими тяжами, семью продольными туловищными стволами, комиссурами и кольцевыми нервами. С помощью антител к серотонину выявлены головной нейропиль, многочисленные тела нейронов в основании вентральной ресничной полоски, окологлоточное нервное кольцо и семь продольных вентральных стволов. Антитела к FMRFамиду позволили обнаружить около десяти нейронов в головном отделе, пять продольных стволов, окологлоточное и каудальное нервные кольца. Представленные данные демонстрируют черты упрощения в строении нервной системы динофи-люса, возможно, связанные с педоморфозом.
Ключевые слова: аннелиды, Dinophilus, тубулин, серотонин (5-НТ), FMRF амид, нервная система.
Ciliary and nervous structures in juvenile females of the annelid Dinophilus gyrociliatus (O. Schmidt, 1848) (Annelida: Polychaeta). E. G. Fofanova, L. P. Nezlin, E. E. Voronezhskaya (Koltsov Institute of Developmental Biology, Russian Academy ofSciences, Moscow 119334)
Ciliary and nerve structures were described in juvenile female Dinophilus gyrociliatus (O. Schmidt, 1848) after immunochemical staining with tubulin, serotonin, and FMRF amide antibodies. Anti-tubulin antibodies visualized the following external structures: two head and seven trunk ciliary bands, a ventral ciliary band, and head ciliary fields. Gut cilia and five pairs of protonephridia were detected inside the body. The nervous system consists of an oval head neuropile with anterior and posterior nerves extending from it, seven longitudinal nerve cords, commissures, and circular nerves. Anti-serotonin antibodies visualized the head neuropile, neurons at the base of the ventral ciliary band, an oesophageal ring, and seven longitudinal ventral cords. Anti-FMRFamide antibodies visualized about ten neurons in the cerebral ganglion, five longitudinal cords, and oesophageal and caudal nerve rings. The presented data suggest the simplification of the nervous system structure in,D. gyrociliatus, which probably reflects pedomorphosis. (Biologiya Morya, 2014, vol. 40, no. 1, pp. 46-56).
Keywords: annelids, Dinophilus, tubulin, serotonin (5-HT), FMRF amide, nervous system.
Последние данные о морфологии беспозвоночных, полученные с применением методов иммуногистохимии и лазерной сканирующей микроскопии, позволили иначе взглянуть на раннее развитие представителей группы Lophotrochozoa (Воронежская, Ивашкин, 2010; Незлин, 2010). В настоящее время проводится ревизия имеющихся данных. Наиболее перспективными представляются два направления: 1) изучение последовательных стадий развития и 2) сравнительный анализ морфологии редких малоизученных групп животных. Одной из таких групп являются представители семейства Dinophilidae (Annelida: Polychaeta). Эти животные привлекают внимание зоологов с момента открытия, так как взрослые особи сочетают в себе признаки нескольких типов и не-
сут черты неотении (Иванов и др., 1941; Беклемишев, 1964; Struck, 2006).
Многие зоологи относили динофилид к эуницид-ным полихетам, придавая особое значение простоте в структуре глоточного бульбуса и морфологии личинок (Беклемишев, 1964; Свешников, 1967; Hermans, 1969; Akesson, 1977), но данные молекулярно-генетического анализа не подтвердили эту точку зрения (Struck et al., 2005; Struck, 2006). Вагин (2007) относил динофилид (вместе с мизостомидами и моллюсками) к надтипу Trochozoa Oligomera, противопоставляя их Trochozoa Heteronomia (аннелиды и архианнелиды). Старобогатов (1983) объединял динофилид и мизостомид в тип Myzostomozoes. Идея о том, что динофилиды - самосто-
1 Исследования поддержаны грантами РФФИ № 12-04-01510, № 12-04-10119 и № 13-04-10164, а также частично проводились в рамках реализации Федеральной целевой программы "Научные и научно-педагогические кадры инновационной России" на 2009-2013 годы при финансовой поддержке Министерства образования и науки РФ (Государственный контракт№ 12.741.12.0155).
ятельный тип, до сих пор находит сочувствие в отечественной литературе (Буруковский, 2010).
Первые упоминания о Dinophilus появились во второй половине XIX века (Schmidt, 1848, цит. по: Hermans, 1969; Harmer, 1889). С этого момента и до начала XX века опубликовано множество работ о находках самых разных видов, выделяемых по количеству сегментов и ресничных шнуров и относящихся к роду Dinophilus (Harmer, 1889; Nelson, 1907; Shearer, 1912). Описано около 10 видов, которые пытались разделить на две группы. Основные диагностические критерии для такого разделения - количество сегментов, строение ресничного аппарата, окраска тела, а главное, жизненный цикл. В результате в первую группу вошли виды без полового диморфизма, во вторую - с крайней степенью полового диморфизма (Nelson, 1907; Shearer, 1912).
В середине XX века были опубликованы работы по биологии Dinophilus, однако их авторы часто или не определяли видовую принадлежность (Jägersten, 1944), либо относили описываемое животное к одному из ранее выделенных видов (Котикова, 1973; Мамкаев, Селиванова, 1979). Вслед за Нельсоном (Nelson, 1907) Хартман (Hartman, 1959) в своем определителе к роду Dinophilus отнес 5 видов, из которых 4 вида (все окрашенные, без выраженного полового диморфизма) входили в первую группу и один вид D. gyrociliatus - во вторую. Позже было показано, что представители всех видов первой группы рода Dinophilus являются одним видом D. taeniatus (Harmer, 1889; Donworth, 1986).
Таким образом, в настоящее время к роду Dinophilus принято относить два вида: D. gyrociliatus и D. taeniatus. Изучение деталей строения ресничных элементов с использованием современных методов актуально для определения систематической принадлежности видов данного рода. Строение нервной системы исследовали в основном на взрослых особях D. taeniatus и D. gyrociliatus, имеются сведения о морфологии нервной системы карликового самца D. gyrociliatus. Причем информация, приводимая разными авторами, весьма противоречива (см. "Обсуждение"). В данной работе проведено детальное исследование ресничной и нервной систем D. gyrociliatus с использованием высокочувствительных методов иммунохимического маркирования, совмещенного с конфокальной сканирующей микроскопией.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДИКА
Культивирование животных
Работа выполнена в лаборатории сравнительной физиологии Института биологии развития (ИБР) им. Н.К. Кольцова РАН. Лабораторная культура динофилид была создана на основе кладок и ювенильных особей, обнаруженных нами в пробах морской воды из Средиземного моря (Неаполитанская зоологическая станция). Взрослых животных содержали согласно методике, описанной ранее (Фофанова, Воронежская, 2008).
Иммуноцитохимическое маркирование
Для маркировки ресничек и нервных элементов использовали антитела против ацетилированного тубулина (моно-клональные, выработанные в мыши, Т-6793, Sigma, USA); для маркировки специфичных нервных элементов - антитела против серотонина (5-гидрокситриптамин, 5-НТ) и нейропептида FMRFамида (все поликлональные, выработаны в кролике, Cat. Nrs. 428002, 410002, Immunostar, USA). Первичные антитела выявляли при помощи вторичных антител против иммуноглобулинов кролика и мыши (goat-anti-rabbit IgG, goat-anti-mouse IgG), меченных флуоресцентными маркерами Alexa-488 и Alexa-546 (все Molecular Probes, USA).
Иммунореакцию проводили на тотальных препаратах ювенильных червей (1-3 дня после вылупления). Животных предварительно расслабляли в 7% растворе MgCl2 на морской воде в течение 2-3 мин. Затем фиксировали 4% параформаль-дегидом (PFA) на 0.01 M фосфатном буфере (PBS, pH 7.4) в течение ночи при температуре 10°С. Последующее иммунохи-мическое маркирование проводили по стандартной методике (Voronezhskaya et al., 2003; Fofanova, Voronezhskaya, 2012). Для двойного окрашивания в одном препарате использовали первичные антитела, выработанные в разных животных, в следующих разведениях: для серотонина и FMRFамида - 1 : 2000, для тубулина - 1 : 5000. Вторичные антитела разводили в пропорции 1 : 800. Ядра маркировали DAPI или Hoechst-33342 (все Molecular Probes, USA) в концентрации 2-3 мкг/мл. Препараты заключали в 70% глицерин в PBS.
Предварительный анализ препаратов производили с помощью эпифлуоресцентного микроскопа DMRXA2 (Leica, Germany) и микроскопа Zeiss Axioskop (Zeiss, Germany). Для детального изучения препаратов использовали лазерные конфокальные сканирующие микроскопы TCS-SPE и TCS-SP5 (Leica, Germany), оборудованные соответствующим набором лазеров, фильтров и детекторов. Двухмерные изображения и трехмерные реконструкции создавали на основе серий оптических срезов с шагом 0.5-0.7 мкм с помощью программ Leica LAS AF и Image J. Чтобы получить иллюстрации, серию оптических срезов проецировали в одно изображение и импортировали в программу Adobe Photoshop CS 3, изменяли только яркость и контрастность изображения. Рисунки 1-3 и 5 представлены в виде монохромных негативных изображений.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Особенности морфологии
Тело червей (самки) практически не окрашено, прозрачно, длина ювенильных особей составляет 0.4-0.6 мм, половозрелых - 0.8-1.5 мм. В теле выделяются головной и туловищный отделы, а также каудальный отросток, отделенный от туловищного отдела бороздой (рис. 1А, Б). В туловищном отделе
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.