УДК 577.112.088
РЕЦЕПТОР-СВЯЗЫВАЮЩИЙ ДОМЕН ЭФРИНА А1: ПОЛУЧЕНИЕ В БАКТЕРИАЛЬНОЙ СИСТЕМЕ ЭКСПРЕССИИ И АКТИВНОСТЬ
© 2012 г. О.В. Некрасова1*, Г.В. Шаронов1, Р.В. Тихонов1, П.М. Колосов3, М.В. Астапова1, С.А. Якимов1, А.И. Тагвей1, А.А. Корчагина2, О.В. Бочарова1, А.Н. Вульфсон1, А.В. Феофанов1,2, М.П. Кирпичников1,2
1 Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, 117997Москва, ул. Миклухо-Маклая, 16/10; факс: +7(495)335-7103, электронная почта: okatja@yandex.ru, office@ibch.ru
2 Московский государственный университет им. М. В. Ломоносова,
Биологический факультет, 119991 Москва; факс:+7(495)939-4309,
электронная почта: info@mail.bio.msu
3 Институт высшей нервной деятельности и нейрофизиологии РАН,
117485Москва, ул. Бутлерова, 5а; факс:+7(499)743-0056, электронная почта: admin@ihna.ru
Поступила в редакцию 21.03.12 После доработки 05.05.12
Эфриновые тирозин-киназные рецепторы (ЕрИ-рецепторы) и их лиганды — эфрины, выполняют важную ре-гуляторную функцию в процессах морфогенеза, а в ряде случаев участвуют и в злокачественной трансформации клеток. Эфрин А1, лиганд ЕрИ-рецепторов А-класса, является модулятором роста и прогрессии опухолей, и механизм этой модуляции требует детального исследования. В настоящей статье мы докладываем о разработке системы бактериальной экспрессии рекомбинантного рецептор-связывающего домена эфрина А1 (еА1), способа его выделения и ренатурации с выходом целевого продукта около 50 мг/л культуры. Наличие специфической активности у еА1 подтверждено методами иммуноблоттинга, лазерной сканирующей конфокальной микроскопии и проточной цитометрии. Показано, что негликозилированный лиганд-связы-вающий домен эфрина А1 в мономерной форме способен активировать рецепторы ЕрИА2 в клетках, стимулируя их фосфорилирование. Лиганд еА1 может быть использован для изучения особенностей взаимодействия эфрина А1 с различными ЕрИ-рецепторами А-класса, а полученная генно-инженерная конструкция — для разработки более активных и избирательных лигандов и экспериментальных систем доставки цитоток-синов в опухолевые клетки, интенсивно экспрессирующие ЕрИА2 или другие ЕрИ-рецепторы А-класса.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: эфрин А1, рецептор-связывающий домен, ренатурация, ВЭЖХ, эфриновый рецептор ЕрИА2.
Тирозин-киназные эфриновые рецепторы и их лиганды — эфрины, участвуют в процессах закладки и формирования органов на этапе эмбрионального развития, регулируют рост и развитие капиллярной сети, направление роста аксонов. Активность эфриновых рецепторов проявляется в изменении цитоскелета, регуляции межклеточных контактов, ослаблении или усилении адгезии и миграции клеток [1, 2]. Многочисленные исследования последнего времени
Принятые сокращения: рецептор-связывающий домен эфрина А1 — еА1; циановый флуоресцирующий белок — СБР; а.о. — аминокислотный остаток; Р-МЭ — Р-меркапто-этанол.
* Адресат для корреспонденции.
посвящены изучению роли эфриновых рецепторов и их лигандов в образовании и прогрессии злокачественных опухолей [3]. Один из эфрино-вых рецепторов, ЕрИА2, высокоэкспрессирован в различных типах солидных опухолей и является медиатором злокачественной трансформации клеток, их роста и метастазирования, а также стимулятором патологического ангиогенеза [4]. ЕрЬА2 рассматривается как перспективная терапевтическая мишень при лечении ряда онкологических заболеваний, при этом ключевую роль в регуляции активности этого рецептора играет лиганд эфрин А1 [4].
Эфрин А1, как и другие эфрины А-класса, локализуется на плазматической мембране клеток и представляет собой экспонированный во
1705
внеклеточное пространство глобулярный белок, С-конец которого связан с мембраной клеток посредством гликозилфосфатидилинозитного (GPI) якоря [1]. Молекула эфрина А1 синтезируется в клетке в виде предшественника (205 а.о.), содержащего на ^-конце сигнальную последовательность, необходимую для экспорта белка через мембрану, а на С-конце — пропептид (а.о. 183—205), который отщепляется при созревании белка [5]. Большая часть аминокислотной последовательности эфрина А1 (а.о. 19—151) участвует в формировании компактного рецептор-связывающего домена, стабилизированного двумя дисульфидными связями и гликозилиро-ванного по остатку Asn 26 [6].
Несмотря на способность эфрина А1 к связыванию с большинством эфриновых рецепторов А-класса [7, 8], наиболее интенсивно изучается его активность в отношении рецептора EphA2. Лиганд-зависимая активация EphA2 происходит в результате его связывания с эфрином А1, экспонированным на мембране соседних клеток, и сопровождается димеризацией комплексов EphA^-эфрин А1, фосфорилированием тирозин-киназного цитоплазматического домена рецептора и развитием сигнального каскада [2]. В результате активации мембранной металлопротеа-зы ADAM10 происходит отщепление эфринов от мембраны [9], что обеспечивает возможность ин-тернализации и внутриклеточной инактивации комплексов EphA^-эфрин А1 [10].
Еще в ранних исследованиях была обнаружена мономерная водорастворимая форма эф-рина А1, которая секретируется в межклеточное пространство, по-видимому, вследствие липаз-ной и металлопротеазной активности [11, 12]. Однако долгое время считалось, что для активации EphA2 необходимо формирование кластеров эфрина А1 на мембране или его «кластеризация» в искусственных конъюгатах [13, 14]. Поэтому для изучения EphA2 широко используется рекомбинантный гибридный белок эфрин А1-Fc, в котором Fc-фрагмент IgG обеспечивает димеризацию растворимого домена эфрина А1. Показано, что на некоторых типах опухолей эф-рин A1-Fc обладает онкосупрессорной активностью in vivo и in vitro: результатом воздействия эфрина A1-Fc является подавление миграции и инвазивности клеток [15], торможение опухолевого роста [16—18]. На основе эфрина A1-Fc разрабатывают новые оригинальные подходы к терапии опухолей. Так, для конъюгатов этого белка с золотыми нанокапсулами показана возможность направленной фототермической деструкции клеток рака простаты [19], а конъюгаты эфрина A1-Fc с экзотоксином А Pseudomonas aeruginosa использовали для адресной доставки токси-
на в БрЬЛ2-экспрессирующие опухолевые клетки [20].
В недавних работах было однозначно показано, что мономерная растворимая форма эфрина Л1 способна к паракринной активации БрЬЛ2 в опухолях [21]. Для изучения активности мономерного лиганда на клеточных линиях были использованы технологии рекомбинант-ных ДНК, обеспечивающие конститутивную секрецию растворимого рецептор-связывающе-го домена эфрина А1 [22, 23].
Разработка новых более простых и малозатратных способов получения рекомбинантного эфрина А1 является перспективной научной задачей с возможными практическими приложениями. В настоящей статье мы докладываем о создании прокариотической системы экспрессии мономерного водорастворимого лиганда эфрина Л1 и о разработке процедуры выделения и ренатурации этого белка. На примере клеток с повышенной экспрессией рецепторов БрЬЛ2 мы демонстрируем, что полученный в бактериальной системе негликозилированный мономерный растворимый эфрин Л1 способен активировать эфриновые рецепторы, вызывая их фосфорилирование.
МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Получение полноразмерного гена эфрина А1.
Выделение РНК и синтез кДНК. Тотальную РНК из клеток культуры MCF-7 (106 клеток) выделяли гуанидин тиоцианатным методом [24]. РНК перед синтезом кДНК обрабатывали ДНКазой I («Boehringer», Германия) 30 мин при 37°, затем смесью фенол : хлороформ (1 : 1) и осаждали этанолом. Синтез кДНК проводили в соответствии с протоколом фирмы «Invitrogen». Реакционная смесь (объем 20 мкл) содержала 500 нг тотальной РНК, 1 мкМ oligo(dT)16 праймера, 0,5 мМ dNTP, 200 ед активности обратной транскрипта-зы M-MLV («Life Technologies», Германия). Смесь инкубировали при комнатной температуре 10 мин, после чего синтез первой цепи кДНК проводили при 37° 1 ч, затем инактивировали фермент при 95° 5 мин. Синтезированную кДНК использовали в качестве матрицы для синтеза второй цепи ДНК.
Амплификация кДНК и клонирование полноразмерного гена эфрина А1. Синтез второй нити кДНК и амплификацию гена эфрина А1 проводили методом ПЦР с помощью прямого (5'-AA-AC4Z47UGAGTTCCTCTGGGC-3') и обратного (5'-AAAC7UG4GCGGGGTTTGCAGC-3') прай-меров. Прямой праймер содержит сайт узнавания рестриктазы NdeI (выделено курсивом), за
которым следует последовательность нуклеоти-дов, представляющая собой 5'-конец ген эфрина Al. Обратный праймер содержит сайт рестрикции XhoI и 16 нуклеотидов, комплементарных последовательности З'-конца гена эфрина Al. Полученный фрагмент ДНК клонировали в вектор pET15-b по сайтам рестрикции NdeI и XhoI. Нук-леотидную последовательность гена в составе плаз-миды рЕТ15Ь-эфрин Al подтверждали секвени-рованием на приборе ABI PRISM 3100-Avant Genetic Analyser («Applied Biosystems», СШЛ).
Конструирование вектора pET23-eA1 для прямой экспрессии рецептор-связывающего домена эфрина А1 (eA1) проводили путем клонирования фрагмента ДНК, кодирующего последовательность 17-153 а.о. эфрина Al, по сайтам BamHI и XhoI плазмиды pET23-a («Novagen», Германия). Соответствующий фрагмент ДНК был получен методом ПЦР на матрице плазмиды рЕТ15Ь-эф-рин Al, содержащей полноразмерный ген эфри-на Al с помощью прямого (5'-TGCAGTGGATCC-GCTGCTGATCGCCACAC-3') и обратного прай-меров (5'-GGCCTGCTCGAGGTGAGTGATTTT-GCCACTG-3'), содержащих, соответственно, сайты рестриктаз BamHI и XhoI (выделено курсивом). Полученная плазмида pET23-eA1 кодировала рекомбинантный белок eAl, содержащий короткие N- и C-концевые последовательности, детерминируемые структурой вектора (Т7 tag и Hisx6 соответственно).
Экспрессия и выделение рекомбинантного eA1. Получение биомассы. Ночную культуру клеток E. coli Rosetta-gamiB(DE3) pLysS («Novagen», Германия), трансформированных pET23-eA1, инокулиро-вали в 50 мл среды ТВ, содержащей 40 мкг/мл канамицина, 34 мкг/мл хлорамфеникола, 12 мкг/мл тетрациклина. Культуру выращивали до OD560 = = 1,0 о.е., индуцировали 0,5 hM ИПТГ и продолжали выращивать 18 ч при 18°. Биосинтез белка детектировали путем разделения белков клеточного лизата электрофорезом в денатурирующем 13
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.