БИОХИМИЯ, 2006, том 71, вып. 2, с. 229 - 236
УДК 577.175.328
РЕЦЕПТОРЫ ПРОЛАКТИНА ХОЛАНГИОЦИТОВ КРЫСЫ: НЕЗАВИСИМАЯ ОТ ПОЛА РЕГУЛЯЦИЯ УРОВНЯ И СООТНОШЕНИЯ ИЗОФОРМ
© 2006 г. Р.Л. Богорад1*, Т.Ю. Остроухова1, А.Н. Орлова1, П.М. Рубцов2, О.В. Смирнова1
1 Биологический факультет МГУ им. М.В. Ломоносова, 119992 Москва; факс: (495)939-4309, электронная почта: rbogorad@yahoo.com 2 Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН, 119991 Москва, ул. Вавилова, 32; факс: (495)135-1405
Поступила в редакцию 08.02.05 После доработки 27.04.05
Исследована экспрессия рецепторов пролактина и его изоформ в клетках желчных протоков (холангиоци-тах), дифференциально изолированных из печени крыс, при различных физиологических состояниях. Обнаружено, что нормальные холангиоциты экспрессируют рецепторы пролактина на относительно низком уровне, сравнимом, однако, с уровнем рецепторов в других пролактинзависимых тканях. В холангиоцитах в отличие от гепатоцитов доминирует длинная изоформа рецепторов пролактина. Уровень рецепторов пролактина увеличивается при обструктивном холестазе благодаря увеличению количества длинной изофор-мы, а также появлению короткой. В отличие от большинства других тканей, в холангиоцитах основными позитивными регуляторами экспрессии рецепторов пролактина являются не половые гормоны и пролак-тин, а факторы, индуцированные обструктивным холестазом. Длинная изоформа рецептора, доминирующая в этих клетках, в большей степени подвержена дополнительной индукции при холестазе.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: холестаз, перевязка желчного протока, ОТ-ПЦР, холангиоциты, рецепторы пролак-тина, изоформы рецепторов.
Пролактин — один из наиболее многофункциональных гормонов. В клетках млекопитающих обнаружено несколько изоформ рецептора пролактина (ПрлР), являющихся продуктами альтернативного сплайсинга пре-мРНК ПрлР. Изоформы ПрлР отличаются длиной и структурой цитоплазматического домена [1, 2]. Для изо-форм рецепторов, в том числе и ПрлР, имеющих разные цитоплазматические домены, зачастую характерна различная биологическая активность [2], а, значит, чувствительность клетки к пролак-тину и характер пролактининдуцированного ответа зависят как от уровня ПрлР, так и от соотношения его короткой и длинной изоформ [3—6].
Печень часто является объектом изучения действия пролактина, что определяется как вы-
Принятые сокращения: ОТ — обратная транскрипция, ОХ — обструктивный холестаз, ПрлР — рецептор пролактина, ПЦР — полимеразная цепная реакция, JAK — (Janus kinase) киназа Януса, STAT — (signal transducer and activator of transcription) проводник сигнала и активатор транскрипции.
* Адресат для корреспонденции и запросов оттисков.
соким содержанием ПрлР, так и особенностями распределения изоформ рецептора. Это одна из немногих тканей, в которой преобладает короткая изоформа рецептора [3, 7]. Ранее именно в печени были выяснены многие особенности регуляции экспрессии ПрлР — зависимость от половых гормонов и самого пролактина [3, 8, 9]. В ряде предыдущих исследований, показано, что и уровень ПрлР, и соотношение изоформ рецептора, характерные для печени, а также особенности их регуляции определяются гепатоцитами, составляющими основную массу печени [3, 10].
Клетки желчных протоков играют важнейшую роль в функционировании печени как в норме, так и при развитии патологии. Особенно велика их роль в формировании желчи. Можно предположить, что пролактин действует также и на холангиоциты, так как во многих типах про-токовых структур он принимает участие в регуляции различных биохимических процессов, в том числе в поддержании водно-солевого баланса, и секреции [1].
Ранее в нашей лаборатории было показано, что ПрлР экспрессируются в пролиферирую-
щих холангиоцитах как в норме, так и при патологии [11, 12]. В настоящей работе рассмотрено влияние половых гормонов, пролактина и обструктивного холестаза на уровень ПрлР и особенности экспрессии его изоформ в холан-гиоцитах крысы.
МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
В работе использовали самок и самцов беспородных белых крыс (200—250 г): использованные экспериментальные группы представлены в табл. 1. Все основные реактивы для выделения клеток и обработки тканей произведены «Sigma» (США).
Перевязка общего желчного протока, гонад-эктомия и ложные операции были проведены, как описано ранее [12, 13]. Для анализа или дальнейших воздействий использовали животных через 14 или 30 дней после операции соответственно.
В ряде экспериментов под почечную капсулу животного трансплантировали два донорских гипофиза (для увеличения концентрации пролактина в крови). Через два дня животным перевязывали общий желчный проток.
Предварительный анализ методом ОТ-ПЦР показал, что самки и самцы с ложной гонадэк-томией и ложной перевязкой желчного протока не отличались от интактных животных ни по содержанию мРНК ПрлР, ни по соотношению его изоформ (Крускал—Уоллис ANOVA тест,p > 0,6).
Для снижения уровня пролактина в крови после перевязки общего желчного протока животным вводили бромокриптин в виде суспензии таблеток бромокриптина («Gedeon Richter», Венгрия) в 50%-ном этаноле (10 мкг на кг веса животного) ежедневно в течение 14 дней. Контрольным животным вводили 50%-ный этанол.
Холангиоциты выделяли в виде фрагментов внутрипеченочных желчных протоков [14]. Печень перфузировали через портальную вену раствором сбалансированных солей Хенкса без ионов Ca2+, Mg2+, содержащим 0,7 мМ EDTA, затем перфузировали буфером, содержащим 0,05% коллагеназы, 40 мМ Hepes и 5 мМ CaCl2 (рН 7,2—7,4). Портальную ткань механически отделяли от гепатоцитов и измельчали, а затем инкубировали при 37° в растворе A: а-МЕМ, содержащий 0,05% коллагеназы, 0,006% ДНКазы и 0,033% проназы. Раствор А меняли на раствор Б: а-МЕМ, содержащий те же ферменты, кроме проназы, которая была заменена на гиалурони-дазу — 0,036%. Полученную суспензию последовательно пропускали через нейлоновые фильтры с диаметром пор 100 и 30 мкм («Millipore»,
США). Оставшиеся на 30-мкм фильтре фрагменты желчных протоков рассматривали под световым микроскопом для контроля чистоты и качества выделения, желчные протоки представляли собой характерные трубчатые структуры (рис. 1). Дополнительное подтверждение фенотипа холангиоцитов получали при помощи ОТ-ПЦР, выявляя кДНК цитокератина 19 — маркера эпителиальных клеток, для контроля степени контаминации гепатоцитами проводили ОТ-ПЦР с праймерами, специфичными к кДНК глюкозо-6-фосфатазы — маркера гепато-цитов [15] (рис. 2). Доля жизнеспособных клеток сразу после выделения фрагментов желчных протоков по результатам окрашивания трипано-вым голубым составляла более 95%.
Суммарную РНК из фрагментов желчных протоков выделяли экстракцией фенолом и хлороформом [16]. Степень деградации РНК и ее чистоту оценивали по соотношению полос 188 и 288 рРНК в агарозном геле и спектрофотомет-рически.
Таблица 1. Экспериментальные группы крыс
Крысы Экспериментальная группа Анализ
Самцы и самки, половозрелые интактные ИГХ1, ОТ-ПЦР
Самцы и самки, неполовозрелые2 интактные ИГХ
Самцы и самки, половозрелые 14 дней ОХ/ложнооперированные ИГХ, ОТ-ПЦР
Самцы и самки, половозрелые гонадэктомированные/ ложнооперированные ИГХ, ОТ-ПЦР
Самцы и самки, половозрелые гонадэктомированные + 14 дней ОХ ИГХ, ОТ-ПЦР
Самцы и самки, половозрелые 14 дней ОХ + инъекции бромокриптина3/14 дней ОХ + инъекции растворителя ИГХ
Самцы, половозрелые трансплантация гипофиза + 14 дней ОХ/ложная трансплантация + 14 дней ОХ ИГХ
Самцы и самки, половозрелые доноры гипофизов —
1 ИГХ — иммуногистохимический анализ (см. Методы исследования).
2 Неполовозрелые животные — животные на 45-й день после рождения.
3 Дозы бромокриптина (см. Методы исследования).
Рис. 1. Выделенные фрагменты желчных протоков без фиксации и окраски. П — просвет, Х — холангиоцит, шкала 25 мкм
кДНК синтезировали при помощи набора SuperscriptlIRT («Invitrogen», США) после денатурации и отжига 465 нг суммарной РНК с 1,5 мкг (dT)15 («Синтол», Россия). Реакцию проводили согласно протоколу производителя.
ПЦР проводили в 25 мкл инкубационной смеси, содержащей однократный буфер для Taq ДНК полимеразы, 100 мкМ dNTP («Fermentas», Литва), 0,5 ед. Taq полимеразы («Диалат», Россия), 2 мкл аликвоты реакции ОТ. В пробы добавляли по 20 пмоль каждого из необходимых олигонуклеотидов («Синтол») (табл. 2). ПЦР проводили обычно в течение 33 циклов (если не отмечено иное) в следующих условиях: 94°, 30 с; 60°, 30 с; 72°, 45 с. ПЦР для выявления фрагментов кДНК цитокератина 19 и глюкозо-6-фосфа-тазы (контроль степени контаминации гепато-цитами) проводили одновременно. Продукты ПЦР визуализировали в агарозном гель-электрофорезе.
Отработка условий полуколичественной ПЦР для оценки содержания мРНК ПрлР была проведена нами ранее [3, 17]. Проверку специфичности ПЦР проводили при помощи гибридизации с олигонуклеотидом Rc, меченным [32P], ПЦР-продуктов, разделенных в агарозном геле, после переноса на мембрану Hybond-N, а также секвенированием клонированых в плаз-миду pBluescriptlIKS продуктов амплификации кДНК изоформ ПрлР.
Полуколичественный ПЦР анализ мРНК ПрлР проводили в следующих условиях: пробы содержали либо олигонуклеотиды Baf, Bar, Rf и Rc (для оценки общего уровня мРНК ПрлР),
либо Baf, Bar, Rf, Rs и Rl (для оценки соотношения мРНК изоформ), мРНК р-актина служила внутренним стандартом в обоих случаях. В каждую пробу добавляли 1 пмоль Rf и Baf, меченных [у-32Р]АТФ при помощи полинуклеотидки-назы. На предварительной стадии экспериментов показано, что экспоненциальной фазой амплификации кДНК р-актина и обеих изоформ ПрлР соответствует интервал с 25 до 33 цикла ПЦР [17]. Для конкурентного анализа кинетики накопления продуктов в ПЦР, реакцию ставили в двух повторах, продукты реакции разделяли в полиакриламидном геле. Количественную оценку проводили, измеряя радиоактивность продуктов ПЦР. Область достоверного выявления продуктов ПЦР и линейного роста логарифма радиоактивности включенного изотопа соответствовала интервалу с 29 по 33 цикл амплификации (рис. 3). Количество кДНК ПрлР выражали в относительных единицах (отношение радиоактивностей изотопа
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.