УДК 615.277.3;576.5
РЕЗИСТЕНТНОСТЬ ОПУХОЛЕВЫХ КЛЕТОК К TRAIL-ИНДУЦИРОВАННОМУ апоптозу В КОНФЛЮЕНТНЫХ КУЛЬТУРАХ
© 2012 г. Р. С. Фадеев1, 2*, А. В. Чеканов1, 2, Н. В. Долгих1, 2, В. С. Акатов1, 2
Институт теоретической и экспериментальной биофизики РАН, 142290, Пущино, Московская область;
*электронная почта:fadeevrs@gmail.com 2Пущинский государственный естественно-научный институт, 142290, Пущино, Московская область
Поступила в редакцию 28.04.2012
Создание препаратов на основе цитокина TRAIL/Apo2L, который вызывает апоптотическую гибель опухолевых клеток, не повреждая нормальные клетки человека, считается одним из перспективных направлений в химиотерапии опухолей. Для оценки возможности использования рекомби-нантных TRAIL необходимо знать, могут ли опухолевые клетки приобретать резистентность к этим белкам. Нами изучено действие рекомбинантного белка TRAIL (izTRAIL) на опухолевые клетки в культуре при низкой и высокой плотности клеточных популяций. Установлено, что в конфлюент-ных культурах значительно возрастает резистентность опухолевых клеток линий НЕр-2, А549, А431 к апоптоз-индуцирующему действию белка izTRAIL. Это выражается, в частности, в увеличении субпопуляции клеток, нечувствительных к izTRAIL. Обнаружено, что резистентность повышается как при низкой, так и при высокой пролиферативной активности клеток НЕр-2. В конфлюентных культурах резистентность клеток НЕр-2 к белку izTRAIL сохранялась при разобщении межклеточных контактов под действием EGTA. Следовательно, для повышения резистентности клеток НЕр-2 в конфлюентных культурах к белку izTRAIL нет необходимости ни в межклеточных контактах, ни в подавлении клеточной пролиферации. Обнаруженный феномен представляет интерес для разработки способов противоопухолевой терапии с использованием цитокина TRAIL/Apo2L.
Ключевые слова: противоопухолевый цитокин TRAIL/Apo2L, опухолевые клетки, конфлюентная культура, резистентность.
Одна из основных задач онкологии состоит в создании препаратов, которые обеспечивали бы гибель опухолевых клеток, не повреждая при этом нормальные клетки и не оказывая токсического действия на организм в целом. Для разработки таких препаратов большой интерес представляет цитокин TRAIL/Apo2L. TRAIL (TNF alpha Related Apoptosis Inducing Ligand) — это природный цитокин, который является интегральным мембранным белком. Экспрессия TRAIL повышена на поверхности таких иммуно-компетентных клеток, как NK-клетки и дендритные клетки. Этот цитокин связывается с проапо-птотическими рецепторами DR4 и DR5 на поверхности опухолевых клеток и вызывает их апоптотическую гибель, не повреждая нормальные клетки [1—5]. Некоторые опухолевые клетки обладают конститутивной устойчивостью к TRAIL [6], что ограничивает противоопухолевый потенциал этого белка. Следует отметить, что опухолевые клетки способны приобретать устойчивость к химиотерапевтическим препаратам [7]. Известно, что резистентность опухолевых клеток к противоопухолевым средствам может повы-
шаться в конфлюентных культурах [8] и в многоклеточных образованиях, сфероидах (multicell resistance) [9—11]. Механизм приобретенной резистентности опухолевых клеток в плотных популяциях остается не ясным [12]. Считается, что при возникновении неблагоприятных условий околоклеточного микроокружения в быстро растущих участках опухолей возможно неспецифическое повышение резистентности клеток к повреждающим воздействиям, и поэтому изучение таких явлений важно для развития противоопухолевой терапии [13].
В представленной работе мы попытались выяснить, повышается ли резистентность клеток опухолевого происхождения к рекомбинантному белку TRAIL в конфлюентных культурах, и, если это так, то насколько значителен такой эффект, зависит ли он от межклеточной адгезии и от пролиферативной активности клеток.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Использовали дихлородиамминплатину (ДДП, цисплатин), этиленгликольтетраацетат (EGTA),
Hoechst 33342, этидий бромид, пероксид водорода, органический буфер HEPES, питательные среды DMEM, F12 и alfa MEM (Sigma, США), эмбриональную телячью сыворотку (Gibco, США), посуду для культивирования клеток (Nunc, Дания).
Получение izTRAIL. Мотив изолейциновой застежки (IEKKIEA)4 (RMKQIEDKIEEILSKIYHIE-NEIARIKKLIGE) [14] синтезирована de novo. Ген izTRAIL синтезировали согласно [15]. Полученный ген клонировали в плазмидном векторе pET101 (Novagen, США). Штамм Escherichia coli BL21(DE3) трансформировали полученным экспрессирую-щим вектором pET101/izTRAIL. Белок нарабатывали в среде TB в течение 12 ч при 18°C, экстрагировали буфером, содержащим 0.1 M трис, 0.2 M NaCl, 50 мМ EDTA (pH 8.0). В результате получили белок izTRAIL, который находился преимущественно (90%) в составе телец включения (данные не приведены). Ренатурацию белка проводили с использованием 6 М раствора гуанидина хлорида с последующим переводом в буфер, содержащий 0.5 М аргинина, 0.5 М NaCl и 200 мМ трис-гидрохлорида (pH 8.0) и 2 мМ дитиотреитол (ДТТ), до конечной концентрации 500 мкг/мл. Полученный izTRAIL (тримерная форма около 80 кДа, мономерная форма — 27 кДа) очищали при помощи металл-аффинной хроматографии на колонке с сорбентом Ni Sepharose High Performance. Чистоту белка определяли при помощи электрофореза в полиакриламидном геле в денатурирующих условиях (SDS-PAGE) и окрашивания красителем Coomassie blue.
Культура клеток. В работе использовали клетки эпидермоидной карциномы гортани человека НЕр-2, эпидермоидной карциномы кожи человека A431 и немелкоклеточного рака легкого человека А549, полученные из Всероссийской коллекции клеточных культур (Институт цитологии РАН, Санкт-Петербург), а также нормальные ме-зенхимные стволовые клетки костного мозга человека, предоставленные фирмой Биолот (Санкт-Петербург). Клетки НЕр-2, A431 и А549 выращивали в среде DMEM с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки, 40 мкг/мл гентамицина, при 37°С в атмосфере 5% СО2. Время удвоения числа клеток в растущих культурах используемых линий составляет примерно 20 ч. Митотические клетки появлялись в культуре через 18—20 ч после посева.
Нормальные мезенхимные стволовые клетки костного мозга человека культивировали в среде alfa MEM с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки, 40 мкг/мл гентамицина, при 37°С, в атмосфере 5% СО2.
Анализ цитотоксичности. Для анализа цито-токсичности клетки высевали в 96-луночные культуральные планшеты по 2.5 х 104, 5 х 104, 105, 2 х 105 клеток/см2 в 100 мкл ростовой среды на
лунку. С этой целью использовали культуры клеток через 3 сут после посева плотностью 2.5 х х 104 клеток/см2. Цитотоксичность оценивали по соотношению живых клеток в опытных и контрольных (необработанных токсическими агентами) образцах культур, культивируемых в течение 24 ч после добавления агентов. Для этого питательную среду из лунок удаляли. Клетки промывали фосфатным буфером и окрашивали в течение 10 мин в 0.2% растворе кристаллического фиолетового в 20% этаноле. После этого клетки промывали, добавляли 1% раствор додецилсульфата Na (SDS), для разрушения клеток, и измеряли оптическую плотность при 560 нм, используя планшетный ридер (Infinite F200, Tecan). Лунки, инкубированные с ростовой средой без клеток, обрабатывали таким же образом и использовали для определения фоновой оптической плотности. Цитотоксический эффект оценивали по отношению разности между оптической плотностью в опыте и фоном к разности между оптической плотностью в контроле и фоном [16].
Определение живых, митотических и апопто-тических клеток в культурах. Долю живых, митотических и апоптотических клеток в культурах определяли с использованием флуоресцентной микроскопии и окрашивания флуоресцентными ядерными красителями Hoechst 33342 и бромидом этидия [17]. Апоптотические клетки определяли визуально по нарушению распределения хроматина, анализируя не менее 500 клеток. Ми-тотические клетки выявляли по распределению хроматина, характерному для метафазы, анафазы, телофазы и цитокинеза.
Проточная цитофлуориметрия. Распределение клеток по содержанию ДНК анализировали по стандартной методике, используя проточный цитофлуориметр (Partec III, Германия) [17].
Статистика. Результаты опытов представляли в виде среднего ± стандартная ошибка (M ± SEM). Опыты проводили не менее чем в пяти повторах (n > 5). Статистическую значимость отличия содержания митотических клеток и клеток в S-фазе клеточного цикла, а также цитотоксического действия различных агентов в редких и конфлюент-ных культурах определяли с использованием критерия Уилкоксона—Манна и Стьюдента.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Избирательное действие белка izTRAIL на опухолевые клетки. Добавление полученного нами белка izTRAIL в концентрации от 1 нг/мл до 20 мкг/мл в культуру мезенхимных стволовых клеток костного мозга человека через 1 сут после посева плотностью 5 х 103 клеток/см2 не вызывало гибели клеток. Количество клеток в опытных культурах составляло 98 ± 5% от количества в
контроле. Добавление белка izTRAIL (100 нг/мл) в культуры опухолевых клеток А549, НЕр-2 и А431 через 1 сутки после посева (2.5 х 104 клеток/см2) снижало количество живых клеток до 4 ± 1, 12 ± 2 и 25 ± 4% от значений в контроле соответственно. Через 2 ч после добавления izTRAIL в большинстве клеток (70—80%) наблюдалось нарушение распределения хроматина, что указывает на вступление клеток в апоптоз. Эти результаты соответствует данным об избирательности токсического действия рекомбинантных белков TRAIL в отношении опухолевых клеток [1, 4].
Повышение резистентности опухолевых клеток НЕр-2 к апоптоз-индуцирующему действию белка izTRAIL в конфлюентных культурах. На рис. 1
представлены результаты изучения цитотоксиче-ского действия izTRAIL, добавленного сразу после посева клеток НЕр-2 (плотность 5 х 104 клеток/см2), а также через 24 и 72 ч после посева. Через 24 ч после посева клетки находились в состоянии пролиферации, судя по увеличению их количества в S-фазе клеточного цикла от 10.0 ± ±1.0 до 22.0 ± 1.8% на ДНК-цитограмме (рис. 2а), а также по числу митотических клеток в культуре (0до 7.3 ± 1.1%). Эти характеристики не отличались статистически значимо от значений, получе
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.