ГЕНЕТИКА, 2007, том 43, № 9, с. 1226-1238
УДК 575.11:575.222.6:599 323.4
ГЕНЕТИКА ЖИВОТНЫХ
РИБОСОМНЫЕ ГЕНЫ В ИНБРЕДНЫХ ЛИНИЯХ МЫШЕИ: МЕЖЛИНЕЙНАЯ И ВНУТРИЛИНЕИНАЯ ВАРИАБЕЛЬНОСТЬ ЧИСЛА КОПИЙ И СТЕПЕНИ МЕТИЛИРОВАНИЯ
© 2007 г. Н. Н. Вейко, Н. О. Шубаева, А. М. Малашенко|, Т. Б. Бескова,
Р. К. Агапова, Н. А. Ляпунова
Медико-генетический научный центр Российской академии медицинских наук, Москва 115478;
e-mail: lyapunova@med-gen.ru
Поступила в редакцию 23.06.2006 г.
Методом количественной дот-гибридизации определено число копий рДНК в тканях мозга пяти ин-бредных линий мышей (AKR/JY, ЖВ/ВЮг^, CBA/CaLacY, 101/ОТ, 129/JY), полученных из коллекции Научного центра биомедицинских технологий В каждой линии изучены от 9 до 12 животных в возрасте 1-2 месяца. Число копий рДНК в диплоидных геномах мышей линии AKR (крайние значения 105-181; среднее ± SD 136 ± 27) и линии NZB (129-169; 148 ± 12) достоверно ниже, чем в линиях СВА (172-267; 209 ± 31), 101 (179-270; 217 ± 30) и 129 (215-310; 264 ± 33). По этому признаку мыши линии NZB относительно гомогенны (CV = 8.1%). В линиях AKR, СВА, 101 и 129 выявлены значимые различия между группами мышей. Значения ^ в этих линиях варьируют от 12.5 до 19.9%. В тех же образцах ДНК после гидролиза рестриктазами MspI или Нра11 определена степень метилирования области 28S рДНК. Независимо от линейной принадлежности, все мыши разделены на две группы. В группе 1 (20 мышей) метилированная фракция составила менее 8% рДНК, в этой группе оказались все 9 мышей линии NZB, 7 из 9 мышей линии 101 и 3 из 10 мышей линии 129. В группе 2 (остальные 29 мышей линий AKR, СВА, 101 и 129) размер метилированной фракции варьировал от 18 до 38%. Обсуждается возможная роль метилирования и геномной дозы рибосомных генов в формировании фенотипической изменчивости (вариабельности количественных признаков) в инбредных линиях мышей.
Инбредные линии мышей широко используются в медико-биологических исследованиях как модели для изучения роли генетических факторов в формировании морфологических и поведенческих признаков и реакций организма на различные воздействия в норме и при патологии. Высокая генетическая однородность особей инбредных линий позволяет получать в экспериментах хорошо воспроизводимые результаты. Эффективность использования линейных мышей в биомедицинских исследованиях возрастает с расширением информации о наследственных особенностях линий. К настоящему времени известны многие характеристики широко используемых линий, включая данные о генотипе, реакциях на различные экзогенные воздействия, физиологических особенностях и наследственных патологиях [1-3] (сводку данных можно найти на сайте www.informatics.jax.org/external/ festing/mouse/docs/).
Инбредные животные обладают более узкой, чем аутбредные, нормой реакции, они более чувствительны к воздействиям факторов внешней среды, менее жизнеспособны и плодовиты. Вместе с тем давно замечено, что у линейных мышей даже после длительного (более 100 поколений) тесного инбридинга сохраняется фенотипическая
изменчивость [4]. При этом изменчивости в значительной мере подвержены количественные признаки. По нашим данным в инбредных линиях (CBA/CaLacY, C57BL/6 и др.) изменчивость таких признаков, как число желтых тел или размер помета, выражена почти так же, как у аутбредных гетерозиготных мышей стока Ku:SHK - коэффициенты вариации составляют 20-30%. Более того, в ряду поколений инбридинга были выявлены генетически детерминированные периодические колебания плодовитости мышей линии CBA/CaLacY, проявляющие высокую отрицательную корреляцию (k = -0.91) с реакцией на мутагенные воздействия. Высказано предположение, что установленные явления детерминированы периодическими изменениями активности генома [5, 6].
Последнее соображение наводит на мысль, что одним из источников фенотипической изменчивости особей внутри инбредной линии может служить мультикопийный комплекс рибосомных генов (РГ, гены рРНК), который обеспечивает необходимое количество рибосом, а следовательно, определенную интенсивность синтеза белка в клетках и эффективность реализации генома.
Рибосомные гены (у животных это гены, кодирующие 18S, 5.8S и 28S рРНК) собраны под одним
промотором в транскрибируемой области рибо-сомного повтора (рДНК). В геномах эукариот ко-пийность РГ варьирует в широких пределах - от нескольких десятков до десятков тысяч (см. обзор [7]). В диплоидном геноме млекопитающих в среднем содержится от 200 до 500 копий рДНК. Тандем-ные кластеры повторов рДНК локализуются в одной или нескольких (до 5-6) парах хромосом, формируя ядрышкообразующие районы (ЯОР). ЯОР хромосом млекопитающих неоднородны в пределах одного генома. В работах, выполненных на клетках человека, показан полиморфизм ЯОР как по числу копий рДНК (от полной деле-ции кластера рДНК до 100 и более копий в кластере), так и по количеству активных и неактивных ("молчащих", как правило, гиперметилиро-ванных) копий РГ [8, 9]. По этим признакам могут существенно различаться ЯОР, локализованные как в разных парах, так и в гомологах одной пары хромосом. Во многих работах показано, что, как правило, каждый ЯОР индивидуальной хромосомы наследуется как менделевский признак [10, 11]. В результате свободной комбинаторики вариантов родительских ЯОР в зиготе потомки одной и той же пары родителей получат разное количество активных и неактивных (метилированных) копий РГ.
Количество рибосомных генов в геноме может проявляться в изменчивости количественных признаков фенотипа. Это показано при изучении фенотипического проявления геномной дозы РГ у дрозофилы [12, 13], в чистых линиях кур [14-16], в трансформированных линиях клеток [17, 18], а в недавних работах - у человека [19-22].
В ранних работах методом насыщающей РНК/ДНК гибридизации было показано, что в диплоидном геноме мышей инбредной линии C57BL/6J содержится примерно 230 копий РГ [23]. Сравнимые данные о числе копий рДНК в геномах мышей разных инбредных линий практически отсутствуют.
Особенностью транскрибируемой области (ТО) рДНК является обогащенность GC-парами оснований (до 80%) и высокая плотность 5'CpG-динук-леотидов - потенциальных сайтов метилирования ДНК с образованием m5CpG. Известно, что в геномной ДНК позвоночных CpG-динуклеотиды находятся преимущественно в метилированном состоянии. В отличие от этого содержание метилированных сайтов в ТО рДНК у млекопитающих невелико и колеблется от 5 до 30% в геномах разных видов [24]. Метилирование разных участков ТО рДНК было изучено в пяти инбредных линиях мышей (Ва1Ь/с, В10^п, С57В1аск, СВА/Са и DBA/2) [25]. Используя чувствительные к метилированию рестриктазы и блот-гибридизацию с зондами на ТО рДНК, авторы цитируемой работы на качественном уровне показали, что у мышей есть фракция интенсивно (плотно) метили-
рованных в ТО копий рДНК, доля которых относительно неметилированных копий заметно различается в разных линиях. В этой же работе отмечено, что метилированные копии рДНК одинаково представлены в разных тканях одного и того же животного и мало различаются у мышей в пределах одной линии.
Гиперметилирование ТО рДНК связывают с отсутствием транскрипции генов рРНК [25-28]. Это предположение подтверждается повышенной устойчивостью плотно метилированных в ТО копий рДНК к гидролизу ДНКазой 1 [25]. Поскольку фенотипическое проявление в количественных признаках могут иметь только тран-скрипционно активные копии рибосомных генов, особый интерес представляет одновременное определение общего количества рДНК и степени метилирования ТО рДНК в индивидуальных геномах инбредных мышей.
Ранее мы разработали модификацию метода количественной дот-гибридизации, позволяющую определять копийность умеренных повторов ДНК в индивидуальных геномах [29]. Позднее метод был адаптирован для одновременного анализа большого числа образцов геномной ДНК [30].
В настоящей работе мы определили число копий рДНК и уровень метилирования 28S рДНК в тканях мозга пяти инбредных линий мышей. Впервые оценка уровня метилирования рДНК осуществлена с использованием варианта метода количественной дот-гибридизации. Показано, что линии мышей существенно различаются по изученным признакам комплекса рибосомных генов. Обнаружена значимая внутрилинейная вариабельность числа копий рДНК и уровня метилирования транскрибируемой области рДНК. Обсуждаются возможные причины (механизмы, пути) возникновения и сохранения гетерогенности по количеству генов рРНК в инбредных линиях мышей.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Инбредные линии мышей. В работе использованы пять инбредных линий мышей из коллекции Научного центра биомедицинских технологий РАМН Содержание и размножение животных в питомнике соответствуют конвенциаль-ным условиям. Всего в опытах использовано 49 мышей в возрасте 1-2 месяца. Ниже приведены краткие характеристики линий. Более подробные сведения можно найти в работе [2] и в Интернете на сайте, указанном выше.
Линия А^иУ (генотип а, с, Н-2к), далее сокращенно обозначается как AKR, выведена в 30-е годы прошлого века, в Y поступила из Джексонов-ской лаборатории У) в 1961 г. Мыши используются в качестве модели для исследований процесса
лейкемической трансформации клеток. У них обнаружена ускоренная гибель клеток костного мозга по механизмам некроза и апоптоза, которая усиливается по мере старения [3]. Особи линии характеризуются низкой эмоциональностью и крайне высокой агрессивностью. Вследствие спонтанного развития лейкемии мыши этой линии короткоживущие. Средняя продолжительность жизни самок - 298, самцов - 326 дней.
Линия NZB/BlOrlY (генотип a, H-2d), далее -NZB, выведена в Новой Зеландии в 1948 г., в Y поступила из Orl в 1986 г. Эта линия широко используется в качестве модели для изучения аутоиммунных заболеваний, прежде всего системной красной волчанки. У мышей развивается аутоиммунный процесс, который приводит к гемолитической анемии и нефропатии и высокому уровню антител к нативной ДНК. Мыши отличаются повышенной агрессивностью, низкой репродуктив-ностью. Более подробные характеристики линии даны в [2, 3]. Мыши этой линии короткоживущие. Средняя продолжительность жизни самок -
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.