МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ, 2004, том 38, № 4, с. 676-683
МОЛЕКУЛЯРНЫЕ МЕХАНИЗМЫ БИОЛОГИЧЕСКИХ ПРОЦЕССОВ
УДК 577.216.35
РИБОСОМНЫЙ БЕЛОК S26 ЧЕЛОВЕКА ИНГИБИРУЕТ СПЛАЙСИНГ СОБСТВЕННОЙ ПРЕ-мРНК
© 2004 г. А. В. Иванов, А. А. Малыгин, Г. Г. Карпова*
Институт химической биологии и фундаментальной медицины Сибирского отделения Российской академии наук, Новосибирск, 630090 Поступила в редакцию 30.09.2003 г.
Изучен сплайсинг in vitro фрагмента пре-мРНК рибосомного белка S26 человека (rpS26), содержащего первый экзон, первый интрон и часть второго экзона. Установлено, что в результате сплайсинга образуются два продукта, один из которых соответствует фрагменту зрелой мРНК rpS26, а другой содержит 19 3'-концевых нуклеотидов первого интрона между первым и вторым экзонами. Показано, что рекомбинантный rpS26 ингибирует образование in vitro обоих продуктов сплайсинга. О специфичности ингибирования свидетельствует отсутствие влияния другого рекомбинантного рибосомного белка человека, S19, на эффективность сплайсинга этого фрагмента пре-мРНК. Методом тоу-принтинга картированы участки связывания пре-мРНК с рекомбинантным rpS26 в районе основного и альтернативного 3'-сайтов сплайсинга первого интрона. Результаты настоящей работы позволяют предположить, что экспрессия гена rpS26 может регулироваться собственным продуктом на стадии сплайсинга по принципу "обратной связи".
Ключевые слова: рибосомный белок S26 человека, пре-мРНК, мРНК, тоу-принтинг, сплайсинг, ин-гибирование сплайсинга.
HUMAN RIBOSOMAL PROTEIN S26 INHIBITS SPLICING OF ITS OWN PRE-mRNA, by Л. V. Ivanov, A. A. Malygin, G. G. Karpova* (Institute of Chemical Biology and Fundamental Medicine, Siberian Branch, Russian Academy of Sciences, Novosibirsk, 630090 Russia, *e-mail: karpova@niboch.nsc.ru). In vitro splicing was studied for a human ribosomal protein (rp) S26 pre-mRNA fragment containing the first exon, first intron, and a part of the second exon. Splicing yielded two products, the first was corresponded to a fragment of the mature rpS26 mRNA and another was retained the 19 3'-terminal nucleotides of the first intron between the first and second exons. Recombinant rpS26 inhibites generation of both splicing products in vitro. The inhibition was specific, because another recombinant human rp, S19, had no effect on the splicing of the pre-mRNA fragment. Toe-printing was used to map the spS26-binding sites of the per-mRNA within the regions of the conventional and alternative 3' splicing sites of the first intron. On the strength of the rusults, rpS26 was assumed to regulate the expression of its own gene at the level of pre-mRNA splicing via a feedback mechanism.
Регуляция экспрессии генов рибосомных белков эукариот - сложный и многоуровневый процесс. Компьютерный и статистический анализ представленных в базе данных UniGene EST, соответствующих мРНК рибосомных белков человека, показал, что в нормальных тканях гены рибосомных белков экспрессируются с разной эффективностью [1]. Известно также, что при злокачественной трансформации клеток человека повышена экспрессия генов некоторых рибосомных белков (см., например, [2]). С другой сто-
Принятые сокращения: rpS19 и rpS26 - рибосомные белки S19 и S26; 5'-UTR - 5'-нетранслируемая область мРНК; SDS - додецилсульфат натрия; DTT - дитиотреитол; EDTA -этилендиаминтетрауксусная кислота; EST - экспрессируе-мые последовательности (expressed sequence tag); PMSF -фенилметилсульфонилфторид (phenylmethylsulfonil fluoride); PBS - фосфатно-солевой буфер; ПААГ - полиакри-ламидный гель. *Эл. почта: кarpova@niboch.nsc.ru
роны, имеется много данных, свидетельствующих о координированной регуляции экспрессии генов рибосомных белков эукариот на стадиях транскрипции [3] и трансляции [4]. Можно предположить, что различия в содержании мРНК отдельных рибосомных белков в клетке связаны с регуляцией экспрессии на стадиях сплайсинга пре-мРНК и деградации мРНК. К настоящему времени показано, что рибосомные белки Б14 [5] и Ь30 [6] дрожжей связываются с областью 5'-сай-тов сплайсинга первого интрона собственных пре-мРНК и тем самым ингибируют их сплайсинг. Кроме того, обнаружено, что комплекс белка Ь30 со своей пре-мРНК поступает в цитоплазму, где происходит диссоциация белка и быстрая деградация РНК [7]. Установлено также, что увеличение содержания рибосомного белка Ь12 Сае-norhabditis elegans в клетке приводит к появлению и быстрой деградации альтернативного продукта сплайсинга пре-мРНК [8]. Значительно меньше
известно о регуляции сплайсинга пре-мРНК ри-босомных белков у высших эукариот. Так, при усилении экспрессии гена рибосомного белка L1 Xenopus laevis происходит накопление промежуточного продукта сплайсинга пре-мРНК, содержащего второй и третий интроны [9], и его специфическая деградация. Крупномасштабный анализ альтернативных форм мРНК генов человека [10] показал, что пре-мРНК как минимум 11 ри-босомных белков могут подвергаться альтернативному сплайсингу с образованием содержащих преждевременные стоп-кодоны мРНК - кандидатов на специфичную деградацию.
Ранее мы показали, что несколько рибосом-ных белков, включая белок S26, связываются с первым интроном пре-мРНК rpS26. Те же белки в значительно меньшей степени связывались с фрагментом зрелой мРНК rpS26 [11]. С помощью специфических антител мы обнаружили также, что rpS26 в ядерном экстракте клеток HeLa связывается с первым интроном собственной пре-мРНК и в меньшей степени с фрагментом мРНК [12].
В настоящей работе изучены сплайсинг in vitro фрагмента пре-мРНК rpS26 человека, содержащего первый экзон, первый интрон и часть второго экзона, и влияние рибосомного белка S26 человека на этот процесс. С помощью метода тоу-принтинга определены участки связывания пре-мРНК с рекомбинантным rpS26.
УСЛОВИЯ ЭКСПЕРИМЕНТА
В работе использовали акриламид, NN'-мети-лен-бмс-акриламид ("Fluka"), РНКазин ("Prome-ga"), ревертазу вируса миелобластоза птиц (AMV-ревертазу, "Kramel Biotech"), Гад-ДНК-полимеразу (фрагмент Кленова) ("СибЭнзим", Новосибирск), смешанный гексадезоксирибонуклеотид dN6 ("Boehringer Mannheim"). РНК-полимераза фага Т7 (450000 ед.акт./мг) получена в Лаборатории биоорганической химии ферментов Института химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН (ИХБФМ СО РАН). Олигодезок-сирибонуклеотиды синтезированы в Лаборатории медицинской химии ИХБФМ СО РАН. [а-32P]GTP (1000 Ки/ммоль) синтезирован в Биотехнологической лаборатории ИХБФМ СО РАН. Клетки HeLa выращены в Лаборатории биохимии нуклеиновых кислот ИХБФМ СО РАН. Ре-комбинантные rpS19 и rpS26 получены, как описано в [13].
Получение ядерного экстракта клеток HeLa.
Клетки HeLa, выращенные в 0.5 л среды до концентрации 5 х 105клеток/мл, осаждали низкоскоростным центрифугированием, промывали 20 мл буфера PBS (137 мМ NaCl, 2.7 мМ KCl, 8 мМ Na2HPO4, 1.5 мМ KH2PO4 и 0.5 мМ MgCl2), ресус-пендировали в 5 мл буфера А, содержащего
10 мМ HEPES-KOH, pH 8.0, 10 мМ KCl, 1.5 мМ MgCl2 и 1 мМ DTT, и выдерживали в течение 10 мин при 0°С. После этого клетки снова осаждали низкоскоростным центрифугированием и осторожно гомогенизировали в 2 мл буфера А. Для выделения ядер полученный лизат центрифугировали 10 мин при 3200 об/мин, супернатант удаляли, осадок центрифугировали 20 мин при 17000 об/мин. Осажденные ядра гомогенизировали в 340 мкл 20 мМ буфера HEPES-KOH, pH 8.0, содержащего 600 мМ KCl, 1.5 мМ MgCl2, 0.2 мМ EDTA, 20%-ный глицерин, 0.5 мМ PMSF и 0.1 мМ DTT, выдерживали 40 мин при 0°С и центрифугировали 30 мин при 17000 об/мин. После этого ядерный экстракт дважды (сначала 15 ч, а затем 4 ч) диа-лизовали при 4°С против 200 мл 20 мМ буфера HEPES-KOH, pH 8.0, содержащего 100 мМ KCl, 0.2 мМ EDTA, 20%-ный глицерин, 0.5 мМ PMSF и 0.1 мМ DTT.
Синтез суммарной кДНК клеток HeLa. К 50 мкл
осветленного низкоскоростным центрифугированием ядерного экстракта клеток HeLa добавляли 50 мкл воды, а затем 10%-ный SDS до 1%-ной концентрации, смесь инкубировали при 37°С 5 мин. Суммарную РНК выделяли с помощью феноль-ной депротеинизации этой смеси с последующим осаждением этанолом и растворяли в воде до концентрации 2 мкг/мкл. кДНК получали обратной транскрипцией 4 мкг суммарной РНК, предварительно инкубированной с 0.5 мкг праймера dN6 (сначала 10 мин при 70°С, затем 10 мин при 0°С). Реакцию проводили в 100 мкл 25 мМ буфера Трис-HCl, pH 8.3, содержащего 50 мМ KCl, 2 мМ DTT, по 100 нмолей dATP, dCTP, dGTP и dTTP, 20 ед.акт. РНКазина и 20 ед.акт. AMV-ревертазы, в течение 40 мин при 42°С.
Получение ДНК-матриц для транскрипции.
Для получения фрагмента кДНК гена rpS26, содержащего первый экзон, первый интрон и часть второго экзона, проводили ПЦР на суммарной кДНК клеток HeLa с использованием двух пар праймеров: I2-F (5'-GGATCCTAATACGACTCAC-TATAGGGCCTGTCTCCGGTCCGT-3'), I1-R (5'-CTGCGAC AGGATGGGAAAAC-3') и I1-F (5'-GGATCCTAATACGACTCACTATAGGGGT-GAGTCTTCTTGCGTGGT-3'), I2-R (5'-AATAG-GCTGCACGTGGCC-3'). После этого проводили ПЦР с использованием смеси полученных кДНК и праймеров I2-F и I2-R и получали искомый фрагмент кДНК (рис. 1).
Синтез РНК-транскрипта. Меченный 32Р РНК-транскрипт получали, как описано ранее [11]. Синтез немеченого транскрипта проводили в 100 мкл 120 мМ буфера HEPES-KOH, pH 7.6, содержащего 20 мМ MgCl2, 4 мМ DTT, по 0.4 мкмоль ATP, CTP, GTP и UTP, 0.1 мг/мл бычьего сывороточного альбумина, 0.2 мМ спермиди-
\I1-F 1
I2-R
Суммарная " кДНК "
I1-F
I2-R 2
Фрагмент гена rpS26
| -экзон - -интрон
Рис. 1. Схема получения ДНК-матрицы для синтеза фрагмента пре-мРНК гр826, содержащего первый экзон, первый интрон и часть второго экзона (1 и 2 - номера экзонов). Использованные при амплификации праймеры схематически изображены стрелками (в направлении от 5'- к З'-концу праймера).
на, 5 мкг ДНК-матрицы, 20 ед.акт. РНКазина и 0.5 ед.акт. Т7-РНК-полимеразы, в течение 3 ч при 37°С. РНК-транскрипт выделяли с помощью электрофореза в 5%-ном денатурирующем ПААГ.
Сплайсинг фрагмента пре-мРНК in vitro и анализ продуктов сплайсинга. Сплайсинг in vitro [32Р]-меченого фрагмента пре-мРНК, содержащего первый экзон, первый интрон и часть второго экзона, проводили, как опи
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.