МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ, 2004, том 38, № 5, с. 937-944
РИБОНУКЛЕОПРОТЕИДЫ: ^^^^^^
ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ КОМПОНЕНТОВ И ФУНКЦИЯ
УДК 576.85.48
РИБОСОМЫ Escherichia coli КАК МОДЕЛЬ ДЛЯ АПРОБАЦИИ НОВЫХ ФОТОАФФИННЫХ АНАЛОГОВ тРНК, СОДЕРЖАЩИХ ОСТАТКИ 6-ТИОГУАНОЗИНА
© 2004 г. И. Н. Лаврик, П. В. Сергиев*, Ä. Ä. Богданов, R. A. Zimmermann1, О. Ä. Донцова
Химический факультет Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова, Москва 119992 department of Biochemistry & Molecular Biology, University of Massachusetts, Amherst, MA 01003, USA
Поступила в редакцию 16.01.2003 г.
На рибосомах Escherichia coli проведено изучение свойств фотореакционноспособных производных тРНК, содержащих остатки 6-тиогуанозина, и их сравнение со свойствами фотореакционноспособных производных тРНК, содержащих остатки диазиринового производного 5-метиленаминоуриди-на. С помощью транскрипции РНК-полимеразой фага Т7 подобраны условия получения функциональных тРНК, содержащих фотореакционноспособные остатки. Реакцию фотохимической модификации проводили при связывании соответствующих тРНК№е транскриптов, несущих фотореакционноспособные остатки аналогов нуклеотидов, с Р-участком рибосомы. Результаты модификации анализировали с использованием направленного гидролиза рРНК РНКазой Н и обратной транскрипции. Показано, что 6-тиогуанозин может рассматриваться как перспективный реагент для изучения РНК-белковых комплексов методами фотохимического сшивания.
Ключевые слова: рибосома, тРНК, фотоаффинная модификация, 6-тиогуанозин Escherichia coli.
ESCHERICHIA COLI RIBOSOMES AS THE MODEL TO TEST NEW PHOTOACTIVATED tRNA ANALOGUES, CONTAINING 6-THIOGUANOSINE, by I. N. Lavrik*, P. V. Sergiev, A. A. Bogdanov, R. A. Zim-mermann1, O. A.Dontsova (Department of Chemistry, M.V. Lomonosov's Moscow State University, Moscow 119899, Russia; e-mail: petya@genebee.msu.su; department of Biochemistry & Molecular Biology, University of Massachusetts, Amherst, MA 01003, USA). Photoreactive derivatives of tRNAs, containing 6-thiogua-nosine or diazirine derivative of 5-methyleneaminouridine were compared as probes to modify Escherichia coli ribosomes. The derivatives of tRNA were synthesized by T7 transcription Proportion of the modified nucle-otide analogues was optimised to obtain good yield, analogue incorporation and binding to the ribosome. Complexes of the tRNA analogues with the ribosomal P-site were irradiated with mild UV light. Cross-links were analysed by oligonucleotide-directed hydrolysis of rRNA by RNase H and reverse transcription. 6-thiogua-nosine was proved to be a perspective reagent for cross-linking studies of complex ribonucleoproteides.
Метод фотоаффинной модификации широко используется при изучении структуры сложных РНК-белковых комплексов, особенно тех, в отношении которых затруднено применение прямых структурных методов. Среди реагентов, используемых для фотохимического сшивания, важное место занимают тиосодержащие фотореакционные аналоги нуклеозидов - 4-тиоуридин (в4и) и 6-тиогуанозин ($6в) (рис. 1а, б) [1]. Облучение этих соединений в составе рибонуклеопротеидных комплексов (РНП-комплексов) мягким ультрафиолетовым светом с длиной волны 330 нм приводит к специфической активации фотореакционной группы при сохранении функциональной
Принятые сокращения: $4и - 4-тиоуридин, $60 - 6-тиогуа-нозин, ТББ-5и - 5-метиленаминоуридин, модифицированный К-оксисукцинимидным эфиром 4-[3-(трифторметил)-3Н-диазирин-3-ил]бензойной кислоты.
* Эл. почта: petya@genebee.msu.su
активности РНП-комплекса. Преимущество этих реагентов состоит в их способности к образованию так называемых сшивок "нулевой длины". Под действием ультрафиолетового излучения в4и и образуют ковалентные связи с аминокислотными остатками и азотистыми основаниями, которые находятся в непосредственной близости от них - на расстоянии до 3 А, а также в конфор-мации, благоприятной для протекания фотохимической реакции, что позволяет установить пространственное окружение нуклеотидного остатка, содержащего фотореакционную группу. Другой важной особенностью тиопроизводных является то, что их введение в молекулу РНК не приводит к значительным изменениям в ее структуре, что существенно затрудняет применение многих других фотореакционных аналогов, в частности ари-лазидопроизводных [2].
a S
HN 1 I
R
HN O^N
I
R
HN
H2N
R
N
CF3
Рис. 1. Структура фотореакционноспособных групп, использованных для получения фотофаффинных реагентов на основе транскриптов, соответствующих тРНКг
Phe
(s6G).
- 4-тиоуридин (s4U). б - 6-тиогуанозин 5-метиленаминоуридин, модифицированный N-оксисукцинимидным эфиром 4-[3-(трифтор-метил)-3Н-диазирин-3-ил] бензойной кислоты (TDB-5U).
s4U успешно применяли для изучения структуры сложных РНП-комплексов, таких как рибосома и сплайсосома [1, 2]. В то же время, в работах по фотоаффинной модификации s6G используют очень редко, несмотря на его фотохимические характеристики, поскольку s6GTP, в отличие от s4UTP, не служит достаточно эффективным субстратом РНК-полимеразы Т7 и не позволяет относительно легко вводить реакционноспособный остаток (s6GMP) в РНК.
Ранее в нашей лаборатории s6G применяли для изучения топографии участка связывания мРНК на рибосоме [3]. Нам удалось получить короткие мРНК-транскрипты (33 н.), содержащие остатки s6G. В данной работе изучали возможность получения более протяженных РНК-транскриптов, содержащих остатки s6G. В качестве модельной РНК использовали тРНК, а в качестве системы для изучения аффинного фотохимического сшивания - рибосомы Escherichia coli, содержащие тРНК, связанные с Р-участком. Специфичность фотохимического сшивания контролировали с использованием другого фотореакционного производного тРНК (рис. 16), несущего остатки диа-зиринового производного, 5-метиленаминоури-дина, реагента, который применяется при изучении структуры рибосомы [3, 4].
За последнее время в изучении структуры про-кариотической рибосомы достигнуты большие успехи. Рентгеноструктурный анализ малой и большой субчастиц рибосом с разрешением 2.43.5 А [5-8] позволил установить многие структурные особенности этого сложного РНП-комплек-са. В частности, с разрешением 5.5 А получены данные о комплексе 70S рибосом Thermus thermophi-
lus с молекулами мРНК и тРНК [9]. В настоящей работе результаты фотохимического сшивания аналогов тРНК в Р-участке рибосомы сопоставлены с данными структурного анализа. Этот подход позволил оценить специфичность используемых фотоаффинных реагентов - аналогов тРНК.
УСЛОВИЯ ЭКСПЕРИМЕНТА
В работе использовали N-оксисукцинимидный эфир 4-[3-(трифторметил)-3Н-диазирин-3-ил] бензойной кислоты, любезно предоставленный Г. Коршуновой.
Плазмиды (кодирующая тРНК№е из дрожжей (YFO), кодирующая тРНК№е из E. coli (CF-10), кодирующая элонгаторную Мет-тРНКМет из E. coli (mMet)) предоставлены О. Уленбеком (Университет Боулдер) и У. Радж-Бандари (Массачусетт-ский Технологический Институт).
6-Тиогуанозин-5'-трифосфат синтезировали согласно [3].
Получение модифицированных тРНК. Реакцию транскрипции РНК-полимеразой Т7 проводили согласно [3], соотношение s6GTP : GTP в реакционных смесях изменяли от 50 : 1 до 5 : 1. Модификацию остатков 5-метиленаминоуридина N-оксисукцинимидным эфиром 4-[3-(трифторме-тил)-3Н-диазирин-3-ил]бензойной кислоты проводили согласно [3, 4]. Т2-фингерпринты получали, как описано в [3]. Аминоацилирование транскриптов, содержащих остатки s6G, проводили согласно [10].
Образование рибосомных комплексов. Связывание тРНК№е с Р-участком, фотохимическое сшивание и разделение рибосомных компонентов в градиенте плотности сахарозы проводили согласно [3, 4]. Модифицированные компоненты рибосомы разделяли электрофорезом в денатурирующем геле [10, 11] и анализировали с помощью РНКазы Н и обратной транскрипции [3, 4].
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Получение молекул тРНК, содержащих остатки s6G
Для получения фотореакционного аналога тРНК, содержащего остатки s6G, использовали транскрипцию РНК-полимеразой Т7. На начальном этапе работы основная задача состояла в выборе условий транскрипции для синтеза s6G-тРНК, поскольку 6-тиогуанозин-5'-трифосфат не является достаточно эффективным субстратом РНК-полимеразы Т7. Ранее мы подобрали условия синтеза коротких РНК длиной 33 н. [3]. В случае 8^-тРНК условия подбирали, изменяя концентрации s6GTP и GTP и их соотношение от 50 : 1 до 5 : 1 (рис. 2а, б). В качестве ДНК-матриц использовали плазмиды, кодирующие различные
S
тРНК под контролем промотора фага Т7, а именно, элонгаторную тРНКМй E. coli (mMet), тРНКРЬе дрожжей (YFO) и тРНКРЬе E. coli (CF-10). При соотношении концентраций s6GTP : GTP = 50 : 1 транскрипция проходила с очень низким выходом на всех трех ДНК-матрицах (рис. 2а, б и данные не показаны) и становилась значительно более эффективной при переходе к соотношению s6GTP : GTP = 5 : 1. (рис. 2а, б и данные не показаны). Относительный уровень включения радиоактивной метки (32Р) в РНК составил 5% в случае дрожжевой тРНКРЬе, 1% - в случае тРНКРЬе E. coli и 0.05% - в случае тРНКМй (рис. 2в). Подобные расхождения могут быть обусловлены различиями в первичной структуре ДНК-матриц. Общее число остатков гуанозина в выбранных тРНК примерно одинаково, однако в дрожжевой тРНКРЬе отсутствует участок из четырех последовательно расположенных остатков гуанозина, что облегчает получение РНК-транскриптов. В то же время, в контрольной реакции, проводимой в присутствии только природных нуклеозид-5'-трифосфатов, включение [а-32Р]иМР в РНК составляло не менее 30%. Учитывая относительную простоту получения, мы решили использовать транскрипты, соответствующие дрожжевой тРНКРЬе.
Для включения 5-метиленаминоуридина в тРНК также использовали транскрипцию РНК-полимеразой Т7. Метиленаминоуридин-5'-трифос-фат является более эффективным субстратом РНК-полимеразы Т7, чем s6GTP [3, 4], поэтому транскрипция происходила с высоким выходом. Включение радиоактивной метки в случае тРНК, содержащей остатки 5-метиленаминоуридина, составляло 15-20%, т.е. было сопоставимо с включением в присутствии только природных нуклео-зид-5'-трифосфатов (рис. 2а). Фотор
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.