БИОХИМИЯ, 2006, том 71, вып. 6, с. 825 - 837
УДК 577.152.1
рН-ЗАВИСИМАЯ РЕГУЛЯЦИЯ АКТИВНОСТИ МИЕЛОПЕРОКСИДАЗЫ*
© 2006 г. И.И. Власова1**, Ю. Арнхольд2, А.Н. Осипов3, О.М. Панасенко1
1 ФГУ НИИ физико-химической медицины Росздрава, 119992 Москва, Малая Пироговская ул., 1а; факс: (495)246-4490, электронная почта: Irina-Vlasova@newmail.ru
2 Institute of Medical Physics and Biophysics, University of Leipzig, Haertelstrasse 16-18, 04107Leipzig, Germany; fax: (49-341)971-5709, E-mail: arnj@medizin.uni-leipzig.de
3 Российский государственный медицинский университет, 117513 Москва, ул. Островитянова, 1; электронная почта: an-osipov@mail.ru
Поступила в редакцию 16.01.06 После доработки 07.02.06
В работе сравнивается пероксидазная и хлорирующая активности миелопероксидазы (МПО) при разных значениях рН. Продемонстрирована возможность использования белков нейтрофилов для измерения активности МПО. Показано, что субстрат пероксидазной реакции (гваякол) предпочтительнее для МПО при нейтральных значениях рН: при рН 7,4 фермент катализирует пероксидазную реакцию, «не замечая» ионы хлора вплоть до концентрации 150 мМ. При низких значениях рН фермент работает по хлорирующему циклу: при равных концентрациях хлорида и гваякола (по 15 мМ) МПО катализирует, в основном, образование гипохлорита. В то же время для пероксидазы хрена не наблюдается существенного влияния C1- на пероксидазную активность фермента даже при сдвиге рН в кислую сторону. С помощью метода MALDI-TOF масс-спектрометрии показано, что только при низких значениях рН (5,0) количество гипохлорита, произведенного в системе МПО + Н2О2 + С1-, может быть достаточно для модификации фосфолипидов (образование хлор- и бромгидринов или лизопроизводных). Таким образом, в присутствии фенольного субстрата пероксидазы появление хлорирующей активности МПО возможно только при низких значениях рН. Это позволяет исключить образование гипохлорита в биологических тканях в норме (рН 7,4) и существенно увеличить его в фагосомах, где рН составляет 4,7-6,0.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: миелопероксидаза, рН, гипохлорит, пероксидазная активность, хлорирующая активность, нейтрофилы.
Миелопероксидаза (донор: Н2О2 оксидоре-дуктаза, ЕС 1.11.1.7) — основной фермент нейтрофилов, играющий важную роль в защите организма от инфекций [1—4]. Кроме пероксидазной активности фермент обладает уникальной способностью катализировать окисление гало-
Принятые сокращения: РБН — раствор белков нейтрофилов; ДТНБ — 5,5'-дитио-2-нитробензойная кислота; ДЭГНГ — 1,1-диэтил-2-гидрокси-2-нитрозогидра-зин; МПО — миелопероксидаза; МХД — монохлордиме-дон; ПХ — пероксидаза хрена; ТНБ — 5-тио-2-нитробен-зойная кислота; ЦТАБ — цетилтриметиламмонийбромид; MALDI-TOF — (matrix assisted laser desorption/ionisation time-of-flight) — масс-спектрометрия; РОРС — 1-пальмито-ил-2-олеоил-от-глицеро-3-фосфохолин; РАРС — 1-паль-митоил-2-арахидоноил-^и-глицеро-3-фосфохолин.
* Первоначально английский вариант рукописи был опубликован на сайте «Biochemistry» (Moscow), Papers in Press, BM 06-006,23.04.2006.
** Адресат для корреспонденции и запросов оттисков.
генидов (Cl-, Br-, I-) и псевдогалогенидов (SCN-) с образованием высокореакционных ги-погалогенитов (ОХ-) [1, 5-8]:
Х- + Н2О2 + ^ ОХ- +H2O OX- + H+ ^ HOX (Х- — галогенид или псевдогалогенид).
(1)
Упрощенная схема функционирования МПО приведена на рис. 1. Взаимодействие Н2О2 с нативной ферри-формой гема МПО приводит к образованию соединения I (реакция 1). Эта форма МПО обладает очень высокой окислительной способностью и может далее участвовать в двух альтернативных реакциях. Первая — двухэлектронное восстановление соединения I галогенидом до нативного фермента (реакция 2)
Рис. 1. Схема превращения МПО в хлорирующем и перок-сидазном циклах
с замыканием так называемого цикла галогени-рования. Вторая — последовательное превращение сначала в соединение II, а затем — в натив-ный фермент в результате одноэлектронного окисления ряда веществ (реакции 3 и 4), которые являются субстратами пероксидаз (перок-сидазный цикл). Таким образом, фермент может проявлять либо галогенирующую, либо перок-сидазную активность [1, 5—13].
Считается, что благодаря высокой концентрации in vivo хлорид является предпочтительным субстратом для соединения I (концентрация Cl— в плазме крови составляет 100—140 мМ), поэтому цикл галогенирования также принято называть циклом хлорирования [1, 11]. Тем не менее, установлено, что МПО эффективно взаимодействует и с другими галогенидами (Вг— и I-), присутствующими в плазме в значительно меньших концентрациях (20—100 и 0,1—0,6 мкМ соответственно) [8].
Несмотря на то, что субстраты пероксидаз-ного цикла МПО присутствуют в малых концентрациях в плазме и внутриклеточном пространстве, их разнообразие (тирозин, серотонин, ас-корбат, урат, нитрит, р-кетоны и др.) позволяет предположить, что они составляют существенную конкуренцию галогенидам при взаимодействии с соединением I [1, 9—14]. Одним из основных субстратов пероксидаз является тирозин — аминокислота, входящая в состав многих белков. Его концентрация в плазме составляет около 0,2 мМ [10]. Кроме того, тирозильные радикалы, окисляя тиоловые группы или ненасыщенные липиды, восстанавливаются до тирозина [15], что стабилизирует его концентрацию.
Наряду с МПО при активации нейтрофилов секретируется также индуцибельная NO-синта-
за. Активные формы азота, как известно, влияют на функцию МПО, и это влияние зависит от многих факторов, особенно от соотношения концентраций Н2О2 и самих активных форм азота [16—18]. Нитрит, один из основных продуктов метаболизма N0, является субстратом пероксидазы. В результате его ферментативного окисления образуется диоксид азота, который является окислителем и наряду с феноксильны-ми радикалами может приводить к пероксида-ции липидов [10, 14].
Активность МПО существенно зависит от рН среды. Известно, что хлорирующая активность возрастает с уменьшением рН [6, 7]. В то же время, пероксидазная активность МПО или пероксидазы хрена (ПХ) слабо зависит от рН в интервале рН 5—8 [9, 19]. Показано, что при нейтральных значениях рН физиологические концентрации ионов С1- не влияют на окисление Ь-тирозина миелопероксидазой [10]. С другой стороны, присутствие субстратов перокси-дазной реакции может дозозависимо ингибиро-вать образование гипохлорита при нейтральных значениях рН [5, 12]. Показано [5], что ряд производных индола и триптамина, которые в присутствии Н202 вызывают накопление соединения II, приводят, соответственно, и к ингибиро-ванию хлорирующей активности МПО. Эффективные концентрации веществ, приводящие к ингибированию, лежат в микромолярном диапазоне при рН 7,4, но они возрастают приблизительно на два порядка при понижении рН до 5,0.
При активации нейтрофилов из азурофиль-ных гранул во внеклеточное пространство сек-ретируется МПО. Гипохлорит — продукт реакции (1), которую катализирует этот фермент, может оказывать сильное повреждающее действие в отношении биологически важных молекул и клеток [2, 20—22]. Как реализуется направленность этого действия? На что расходуется Н2О2, образовавшаяся в результате «окислительного взрыва» фагоцитов? От соотношения пероксидазной и хлорирующей активности МПО зависит не только эффективность клеточного ответа в отношении патогена при кислых значениях рН, которые наблюдаются в фагосо-мах [2, 6, 7], но и повреждающее действие ги-похлорита при нейтральных значениях рН.
В настоящей работе мы попытались ответить на вопрос, как соотносятся пероксидазная и хлорирующая активности МПО в разных условиях: в норме, когда биологические жидкости, как правило, имеют нейтральное значение рН, и при клеточном ответе, т.е. в образованных нейт-рофилами фагосомах с кислым значением рН. В работе показана возможность использования раствора белков нейтрофилов для измерений
активности МПО. Установлено, что выбор субстрата пероксидазного или галогенирующего циклов МПО зависит от рН среды. При нейтральных рН и при наличии субстратов перокси-дазы МПО не катализирует образование гипо-хлорита, в то время как при понижении рН весь окислительный потенциал соединения I расходуется на образование гипохлорита. Кроме того, показано, что образование гипогалогенитов регулируется активными формами азота.
МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Реактивы. Все соли, использованные в работе для приготовления буферных растворов, а также NaCl, NaBr, лимонная кислота, гваякол (2-метоксифенол), цетилтриметиламмонийбро-мид (ЦТАБ), 2,5-дигидроксибензойная кислота, трифторуксусная кислота, реактив Фолина для определения белка и пероксидаза хрена были получены от фирмы «Sigma-Aldrich» (США). В работе использовали также таурин, метионин, монохлордимедон (МХД), 5,5'-дитио-2-нитро-бензойную кислоту (ДТНБ), NaN3 («Fluka», Швейцария); салицилгидроксамовую кислоту, гидразид 4-аминобензойной кислоты («Aldrich Chemical Co.», США); МПО из человеческих полиморфно-ядерных лейкоцитов («Planta Natural Products», Австрия); 1-пальмитоил-2-олеоил-5«-глицеро-3-фосфохолин (РОРС), 1-пальмитоил-2-арахидоноил-5«-глицеро-3-фос-фохолин (РАРС) («Avanti Polar Lipids», США). Донор NO — 1,1-диэтил-2-гидрокси-2-нитрозо-гидразин (ДЭГНГ) («Cayman Chemical Co.», США) спонтанно продуцирует 1,5 моль NO на моль ДЭГНГ с периодом полураспада 16 мин при 22—25°.
Рабочий раствор H2O2 готовили разведением 30%-ного раствора («Merck», Германия). Раствор HOBr (10 мМ) готовили непосредственно перед экспериментом смешиванием равных объемов растворов 20 мМ гипохлорита и 20 мМ NaBr [23].
Нейтрофилы выделяли из свежей крови здоровых доноров с использованием гепарина (10 ед/мл) в качестве антикоагулянта. Выделение клеток проводили после седиментации эритроцитов (кровь отстаивали в течение 1 ч при комнатной температуре) с использованием центрифугирования на градиенте плотности фикол-урогра-фин (плотность смеси 1,078 г/см3, центрифугирование 20 мин 400 g), лизиса оставшихся эритроцитов дистиллированной водой и двукратной отмывки нейтрофилов раствором Хенкса, не содержащим Сa2+ и Mg2+ [24]. Осаждение клеток проводили с помощью центрифугирования в те-
чение 10 мин при 400 g. Все
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.