БИОХИМИЯ, 2006, том 71, вып. 8, с. 1129 - 1139
РНК-БЕЛКОВЫЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ НА НАЧАЛЬНЫХ И КОНЕЧНЫХ ЭТАПАХ БИОСИНТЕЗА БЕЛКОВ В РАБОТАХ Л.Л. КИСЕЛЕВА
(К 70-летию со дня рождения)
© 2006 г. А.А. Богданов1*, В.Л. Карпов2
1 МГУ им. М.В. Ломоносова, 119992 Москва; факс: (495) 932-8846, электронная почта: bogdanov@belozersky.msu.ru 2 Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН, 119991 Москва, ул. Вавилова, 32
Поступила в редакцию 03.04.06 Л.Л. Киселев
Обзор работ Л.Л. Киселева и его сотрудников за период 1961—2006 гг., касающихся исследования начальных и конечных этапов биосинеза белков. Описаны основные результаты, полученные лабораторией Л.Л. Киселева при изучении пространственной структуры молекул тРНК, структуры и функции аминоацил-тРНК-синтетаз высших организмов, изучении конечных этапов биосинтеза белков — терминации трансляции. Подчеркивается, что Л.Л. Киселеву и его коллегам принадлежат три основополагающих достижения в этих областях молекулярной биологии: первое, гипотеза о роли антикодона тРНК как участка специфического узнавания тРНК «своими» аминоацил-тРНК-синтетазами, получившая полное подтверждение и вошедшая в учебники, второе, идентификация, установление первичной структуры и функции двух белковых факторов эукариот (еЯП и еКРЗ), играющих ключевую роль при терминации трансляции, третье, расшифровка участка узнавания стоп-кодонов фактором eR.F1 в рибосоме и открытие негативных элементов, ограничивающих узнающую способность eRF1 в отношении одного или двух стоп-кодонов. Приводится список избранных публикаций Л.Л. Киселева.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: биосинтез белков, транспортные РНК, аминоацил-тРНК-синтетазы, РНК-белковое узнавание, терминация трансляции, факторы освобождения полипептидных цепей, структурно-функциональный анализ.
Начало научной работы Л.Л. Киселева относится к 1958 г., когда, будучи студентом кафедры биохимии Московского государственного университета (Биолого-почвенный факультет), он стал первым дипломником аспиранта той же кафедры В.П. Скулачева. Итог этих исследований, посвященных сопряжению дыхания и фосфо-рилирования, отражен в четырех публикациях 1959-1960 гг. [1-4].
На выдающиеся способности студента Л.Л. Киселева обратили внимание заведующий кафедрой биохимии С.Е. Северин и Р.Б. Хесин, который создавал тогда свою лабораторию в Радиобиологическом отделе (РБО) Института атомной энергии им. И.В. Курчатова. Но стать аспи-
* Адресат для корреспонденции и запросов оттисков.
рантом МГУ или сотрудником РБО Л. Киселеву было не суждено. В первом случае без внимания партбюро факультета не осталась активная ан-тилысенковская деятельность студента Киселева, и оно резко возражало против того, чтобы в МГУ оставался «менделист-морганист, боровшийся с учением Лысенко и не признавший ошибок» (цитата из характеристики, выданной Л. Киселеву при окончании МГУ). Во втором случае помешало то обстоятельство, что в возрасте 5-8 лет во время Отечественной войны (1941-1945 гг.) мальчик был на оккупированной территории и был освобожден Красной Армией в мае 1945 г. уже в г. Хемнише (Германия).
Третье приглашение было получено от профессора кафедры, читавшего студентам-биохимикам курс энзимологии, В.А. Энгельгардта. В
начале 1959 г. Академия наук СССР приступила к выполнению решения, принятого еще в 1957 г., но не реализованного из-за сопротивления «мичуринских биологов», о создании в АН СССР нового Института радиационной и физико-химической биологии. Открылись вакансии, и на должность стажера-исследователя был приглашен вместе с другими молодыми специалистами и Л. Киселев.
Первая работа, выполненная Л.Л. Киселевым в стенах ИРФХБ АН СССР (ныне Институт молекулярной биологии им. В. А. Энгельгардта РАН) была, с одной стороны, довольно необычной, а с другой стороны, достаточной характерной для того времени. В годы становления отечественной молекулярной биологии многие физики переключились на изучение биологических макромолекул. Так физик, Н.А. Киселев, известный уже в то время специалист в области электронной микроскопии, вместе со своим двоюродным братом Львом Киселевым решили рассмотреть в электронном микроскопе молекулу «растворимой» (транспортной) РНК. Размеры этих молекул крайне невелики (от 75 до 90 нуклеотидов), и никому в голову не приходило заниматься микроскопией таких мелких объектов. Тем не менее, благодаря экспериментальному мастерству Н.А. Киселева и высокому качеству препарата, предоставленного Л. Киселевым, молекулы тРНК удалось не просто увидеть, но и оценить их форму [5]. Это было первое из обширного цикла исследований тРНК и аминоацил-тРНК-синтетаз (ааРСаз), выполненных Л.Л. Киселевым и его сотрудниками с начала 1960-х вплоть до конца 1990-х годов.
СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНЫЙ АНАЛИЗ тРНК И ааРСаз
В середине 1950-х годов Ф. Крик предложил адапторную гипотезу, согласно которой между генетической информацией, записанной в нуклеиновых кислотах, и белками должен находиться молекулярный «адаптор», позволяющий перейти от нуклеотидного «алфавита» к аминокислотному. В конце 50-х — начале 60-х годов было экспериментально доказано [6], что, молекула-адаптор действительно существует. Это — молекула тРНК (трансферная, или транспортная РНК). Молекулы тРНК обладают двумя важнейшими, неразрывно сцепленными друг с другом функциями: способностью присоединять к своему З'-концу аминокислотный остаток при каталитическом участии ферментов ааРСаз (КФ 6.1.1); и взаимодействовать своим триплетом (антикодоном) с кодоном (тринуклеотидом)
матричной РНК (мРНК), находящимся в рибосоме. Функция тРНК, как переводчика, осуществляется на дорибосомной стадии, где благодаря взаимодействию в «треугольнике» аминокисло-та—ааРСаза—тРНК происходит ковалентное высокоизбирательное соединение аминокислоты со «своей» тРНК. Ошибка в специфичности акцептирования аминокислоты тРНК не может быть исправлена на стадии кодон-антикодонно-го взаимодействия, и, следовательно, безошибочность воспроизведения генетической информации определяется не только рибосомными стадиями белкового синтеза, но и дорибосомны-ми (акцептирование аминокислоты тРНК). Поэтому изучение тРНК и ааРСаз относится к фундаментальным, ключевым проблемам молекулярной биологии. Неслучайно Р. Холли за расшифровку первичной структуры аланиновой тРНК был удостоен Нобелевской премии.
Поскольку группа Л.Л. Киселева была первой в СССР, которая сделала тРНК своим основным объектом изучения, то прежде всего было необходимо создать методическую базу и иметь достаточное количество высокоочищенной тРНК как суммарной, так и индивидуальной. Если первая задача была решена сравнительно легко [7], то вторая потребовала разработки оригинального метода [8], и это была первая работа среди многих, выполненных Л.Л. Киселевым совместно с Д.Г. Кнорре и его сотрудниками.
Чтобы понять, как функционирует молекула тРНК в рибосоме и вне ее в цитоплазме, необходимо было знать ее физические свойства и мак-ромолекулярную структуру. Эта задача была решена Л. Киселевым с помощью набора методов, применявшихся ранее при исследовании полимеров (в том числе биополимеров) большого молекулярного веса. Трудность здесь состояла в том, что молекулы тРНК имеют небольшой размер и, соответственно, полимерные свойства выражены у них очень слабо. Несмотря на эту серьезную трудность, удалось применить совокупность физических методов исследования (седиментация, вязкость, диффузия [9—12], двулуче-преломление в потоке [13]; круговой дихроизм и оптическое вращение, спектрофотометрия, флуоресценция, в том числе поляризованная [14—17]; микрокалориметрия [18], рентгеновское рассеяние под малыми углами [19]), дополненных химической модификацией оснований тРНК [20—23]). Разумеется, эти работы велись в тесном контакте со многими отечественными лабораториями в основном физического профиля.
Из совокупности полученных результатов вытекали следующие основные выводы:
1) вторичная структура тРНК в растворе, несмотря на малые размеры молекулы, подчиняется
тем же закономерностям, которые были установлены ранее для высокомолекулярных РНК (ри-босомных, вирусных)другими исследователями (П. Доти, Ж. Фреско, А. Спирин и др.), количественно измерено соотношение двуспиральных и однотяжевых участков в структуре тРНК;
2) молекула тРНК состоит из двух доменов (двуспиральных участков, шпилек), находящихся под углом друг к другу; этот вывод много лет спустя был подтвержден рентгеноструктурным анализом кристаллов фенилаланиновой тРНК (А. Рич, А. Клуг и др.);
3) в молекуле тРНК содержится три экспонированных участка (не входящих в двуспи-ральные области) — антикодоновый участок, ССА-конец и участок между двумя доменами; этот вывод, полученный на валиновой тРНК, подтвержден другими авторами на тРНК другой аминокислотной специфичности;
4) обнаружено специфическое кодон-анти-кодоновое взаимодействие в растворе вне рибосом на примере фенилаланиновой тРНК и по-ли(и); этот опыт [24] прямо доказал существование экспонированного антикодона в трехмерной структуре тРНК в растворе и его способность образовывать специфический дуплекс с кодоном мРНК; через пять лет рентгенострук-турный анализ кристаллов тРНК№е подтвердил правильность этих данных;
5) детально изучено сворачивание и разворачивание молекулы тРНК в растворе и выяснена роль Mg2+ в этом процессе [25—27].
Все перечисленные выше результаты в совокупности с расшифровкой первичных структур тРНК, выполненной в 1960—70 годы во многих лабораториях, стали структурной основой изучения функциональных свойств тРНК как при их взаимодействии с ааРСазами, так и их функционировании в рибосомах.
Основное внимание при изучении ааРСаз (см. обзоры [28, 29]) лаборатория Л. Киселева уделяла ферментам эукариот, поскольку они были изучены значительно хуже ааРСаз бактерий. При этом использовали совокупность классических методов молекулярной энзимоло-гии (выделение индивидуальных ферментов, кинетический анализ, использование аналогов субстратов и т.д.) и генной инженерии. Основные результаты сводятся к следующим.
Установлена аминокислотная последовательность триптофанил-тРНК-синтетаз человека и кролика
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.