МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ, 2004, том 38, № 2, с. 276-287
МОЛЕКУЛЯРНЫЕ МЕХАНИЗМЫ БИОЛОГИЧЕСКИХ ПРОЦЕССОВ
УДК 577.218
РНК-ИНТЕРФЕРЕНЦИЯ, ИНДУЦИРОВАННАЯ ВРЕМЕННОЙ И ПОСТОЯННОЙ ЭКСПРЕССИЕЙ ШПИЛЕЧНОЙ РНК, В КЛЕТКАХ Drosophila И МЛЕКОПИТАЮЩИХ
© 2004 г. K. Ui-Tei123, R. Ueda24, S. Zenno1, F. Takahashi123, N. Doi1, Y. Naito1, M. Yamamoto2, N. Hashimoto2, K. Takahashi4, T. Hamada5, T. Tokunaga6, K. Saigo1*
department of Biophysics and Biochemistry, Graduate School of Science, University of Tokyo, 7-3-1 Hongo, Bunkyo-ku,
Tokyo 113-0033, Japan
2Mitsubishi-Kagaku Institute of Life Sciences, 11 Minami-ooya, Machida-shi, Tokyo 194-8511, Japan
3UPBSB, School of Science, University of Tokyo, 7-3-1 Hongo, Bunkyo-ku, Tokyo 113-0033 Japan 4Genetic Strain Research Center, National Institute of Genetics, Mishima, Shizuoka 411-8540, Japan 5Laboratory for Stem Cell Translational Research, Center for Developmental Biology, RIKEN, 2-2-3 Minatojima-minamimachi, Chuo-ku, Kobe 650-0047, Japan 6Development and Differentiation Laboratory, Developmental Biology Department, Insect and Animal Sciences Division, National Institute of Agrobiological Sciences, Ikenodai 2, Kuisaki, Inashiki, 305-0901, Ibaraki, Japan
Поступила в редакцию 02.06.2003 г.
РНК-интерференцию можно индуцировать с помощью плазмид, содержащих инвертированные повторы, транскрипция которых приводит к образованию двухцепочечной РНК со шпилечной структурой. С использованием системы из двух различных люцефераз изучали влияние структуры конструкций, содержащих инвертированные повторы, на РНК-интерференцию в клетках Drosophila и млекопитающих. Показано, что активность РНК-интерференции сильно зависит от длины инвертированного повтора, а также от длины и нуклеотидной последовательности петли, разделяющей его смысловую и антисмысловую цепи. В культуре клеток Drosophila РНК-интерференцию можно вызвать как временной, так и стабильной трансфекцией плазмиды, несущей инвертированные повторы. Известно, что нестабильная трансфекция клеток млекопитающих такой плазмидой может индуцировать временную РНК-интерференцию. Нами показана возможность постоянной РНК-интерференции в культуре клеток млекопитающих, стабильно трансформированных плазмидой, содержащей инвертированные повторы. В культуре клеток дрозофилы РНК-интерференция, индуцированная плазмидой с инвертированными повторами, менее активна, чем РНК-интерференция, вызванная длинной двухцепочечной РНК. Согласно цитологическим данным, это может объясняться нарушением процессинга шпилечной РНК в клетках. Изучена также РНК-интерференция во взрослых мухах Drosophila, индуцированная трансфекцией конструкции, несущей инвертированные повторы. С использованием extramacrochaetae в качестве модельного гена показали, что для эффективной РНК-интерференции необходимо присутствие интрона в петле, разделяющей смысловую и антисмысловую цепи инвертированного повтора.
Ключевые слова: РНК-интерференция, инвертированные повторы, двухцепочечные РНК, Drosophila.
ВВЕДЕНИЕ
РНК-интерференция (РНКи) - это эволюци-онно консервативный механизм, индуцируемый двухцепочечной РНК (дцРНК) и приводящий к специфическому подавлению гомологичных генов [1]. У низших эукариот введение в культуру клеток длинной дцРНК, гомологичной гену-мишени, вызывает быструю и последовательность-специфичную деградацию мРНК [2]. дцРНК подвергается ферментативному процессингу и разрезается дцРНК-специфичной РНКазой типа III Dicer на фрагменты длиной 21-23 н. [3]. Эти ко-
* Эл.почта: saigo@biochem.s.u-tokyo.ac.jp
роткие дцРНК названы малыми интерферирующими РНК (им-РНК) [4]. У млекопитающих РНКи, индуцированная длинными дцРНК, наблюдается только в ограниченном числе клеток [5, 6], хотя химически синтезированные им-РНК вызывают эффективную РНКи в различных типах клеток [7].
И им-РНК, генерируемые Dicer in vivo, и синтетические им-РНК, добавленные к клеткам, внедряются в RISC (ингибиторный комплекс, содержащий интерферирующие РНК, ИРСИК; RNA-in-duced silencing complex). Считается, что функция им-РНК в RISC состоит в узнавании мРНК-мише-ни, подлежащей деградации [8, 9]. Недавно пока-
зали, что RISC содержит не только им-РНК, но и несколько белковых компонентов, включая белок с PIWI-доменом, который, по-видимому, взаимодействует с Dicer в клетках [10, 11].
Несмотря на очевидную значимость РНКи для фунциональной геномики, к настоящему времени удалось обеспечить только временное подавление экспрессии генов с помощью РНКи, индуцированной трансфекцией дцРНК, [2, 5, 12]. Поэтому создание и введение ДНК с инвертированными повторами (IR), кодирующими шпилечные дцРНК, в клетку или в организм может быть важным для изучения стабильного фенотипа клеток или функций генов, действующих на поздних стадиях развития. Возможность индукции РНКи введением трансгена показана у нематоды Caenorhabditis elegans [13], Drosophila [14, 15], Arabidopsis [16] и млекопитающих [17, 18]. Предполагается, что структура плазмид, вводимых в клетку, влияет на эффективность РНКи.
В этой работе мы определили характеристики плазмид, которые кодируют длинные шпилечные РНК (IR-плазмиды), необходимые для эффективной РНКи в культуре клеток S2 Drosophila, во взрослых мухах и в культурах клеток млекопитающих, включая клетки яичников китайского хомячка (CHO-K1).
УСЛОВИЯ ЭКСПЕРИМЕНТА
Культуры клеток и синтез дцРНК. Клетки S2 Drosophila культивировали при 25°C в среде Schnieder ("Gibco BRL"), содержащей 10% инакти-вированной нагреванием эмбриональной сыворотки крупного рогатого скота (FBS, "Mitsubihi Kasei") и антибиотики - пенициллин (10 ед./мл, "Meiji") и стрептомицин (50 мкг/мл, "Meiji"), во влажной атмосфере (5% CO2 и 95% воздуха). Клетки млекопитающих (CHO-K1, CHL и Don (D-6) китайского хомячка; BHK-21 и первичная культура клеток головного мозга сирийского хомячка; HeLa, HEK 293, PA-1, OVK18 и NEC18 человека; COS и Vero мартышки; FMH-1 крупного рогатого скота; HM-1 и NIH3T3 мыши; RGC-6 крысы) культивировали в среде Игла, модифицированной Дульбекко (D-MEM, "Gibco BRL"), содержащей 10% FBS и антибиотики, при 37°C.
дцРНК люцеферазы (Luc) светлячков синтезировали согласно [6]. Фрагменты длиной 696 п.н. (-35.-661) или 1344 п.н. (-35...-1309) гена люцеферазы (luc) светлячка (P. pyralis) (acc. no A47296) светлячка (P. pyralis), фрагменты длиной 544 п.н. (-35.-616) и 696 п.н. (-9.-535) гена luc (acc. no A28028) Renilla reniformis, фрагмент 1228 п.н (916.2204) гена frizzeled2 (Dfz2) Drosophila me-lanogaster (acc. no U65589) [20] клонировали по соответствующим сайтам рестрикции в плазми-ду pBluescript, содержащую промоторы T7 и T3
("Stratagene"). Матрицы для синтеза РНК получены с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) с использованием двух праймеров RV-P-3 и M13-20 ("Takara"). Смысловую и антисмысловую цепи РНК синтезировали с помощью RiboProbe In Vitro Transcription Systems ("Promega"). дцРНК получали, отжигая смысловую и антисмысловую цепи РНК в 10 мМ Трис-HCl (pH 7.5), содержащем 20 мМ NaCl. дцРНК Ago2 синтезировали с использованием в качестве матрицы ПЦР-амплифицированной с прай-мерами GATAAAGTACGCAGCCACATCGACи TGGTGTTCTTCATCATCGGCAGAC кДНК эмбриональной РНК дрозофилы, и RiboMax Large Scale RNA Production System ("Promega").
Конструирование плазмид, содержащих IR.
Плазмиды, несущие IR-фрагменты генов luc светлячка или Renilla, сконструировали из производного pSC-2, вектора, содержащего спаренные сайты SfI (Sfil-A и Sfil-B) и CpoI-сайт (K.S. и S.Z., неопубликовано). Фрагменты гена luc, использованные в этом опыте, получены из вектора pGL3-control ("Promega"), экспрессирующего ген luc светлячка. Фрагменты гена luc Renilla получены из плазмиды pRL-TK (expression vector Renilla luc, "Promega"). Использовали фрагменты 245 п.н. (1306-1550), 356 п.н. (1306-1661), 696 п.н. (-35.-661) гена luc светлячка и фрагмент luc Renilla длиной 1544 п.н. (-9.-535). Каждый фрагмент амплифицировали с помощью ПЦР и встраивали в Sfil-A/B- или CpoI-сайты в противоположной ориентации (рис. 1). Фрагменты, содержащие IR, вырезали из плазмиды с помощью рестрикта-зы NotI и встраивали в плазмиды: pCI-neo, содержащую цитомегаловирусный промотор (CMV, "Promega"); pdtN (производная pUC-dt [19]) с промотором гена тРНК; pMK33/HS с промоторами гена металлотионеина (Mt) и генов теплового шока (HS) [20]; pUAS, содержащую промоторы UAS и HS [21]; pIZ/V5-His, несущую промотор Op1E2 ("Invitrogene"), и pMT/V5-His c промотором Mt ("Invitrogene"). В результате получили плазмиды CMV-X-IR, tRNA-X-IR, Mt-HS-X-IR, UAS-HS-X-IR, Op1E2-X-IR, Mt-X-IR, гле X - длина фрагмента (п.н.), встроенного по SfI-A/B-сайтам. Использовали следующие интронные фрагменты: фрагмент размером 254 п.н., содержащий интрон 1 (230 п.н.) гена late leader аденовируса (A12, [22]); фрагмент 282 п.н, содержащий интроны 5 (55 п.н.), 6 (60 п.н., D13), и фрагмент 87 п.н., содержащий интрон 6 (D23) гена ret Drosophila [23]. После присоединения линкера, несущего EcoRI-сайты, эти интроны ввели между смысловой и антисмысловой цепями в прямой или в обратной ориентации.
Определение активности РНКи и получение стабильно трансфицированных линий клеток.
Трансфекцию клеток и определение активности
110 п.н.
Notl * Notl
pMK33/HS-1 Mt H hs \-r-
pUAST-UA^CHSI^
plZ/V5-His-1 OplE2 -
pMT/V5-His-1 Mt br-
-200 п.н. Notl
Рис. 1. Экспрессионные конструкции, кодирующие lR длиной 696 п.н. гена luc светлячка. PSC-2 - вектор для создания lR, который содержит Sfl-A-, Sfil-B- и Cpol-сайты рестрикции (см. "Условия эксперимента"). После рестрикции по Cpol-сайту образуются два липких конца c различной нуклеотидной последовательностью. Фрагмент гена luc светлячка длиной 696 п.н. (1306-1550) амплифицирован c помощью ПЦР с плазмиды pGL3-control. В качестве праймеров использовали олигонуклеотиды, содержащие Sfil-A-, -B или Cpol-сайты. Амплифицированный фрагмент встроили в вектор pSC-2 по сайтам рестрикции Sfi- или Cpol в противоположной ориентации и получили плазмиду pSC-2-296. Фрагмент, содержащий lR, вырезали рест-риктазой Notl и встраивали по Notl-сайту в плазмиду pCl-neo, содержащую цитомегаловирусный промотор (CMV); pdtN с пр
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.