МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ, 2004, том 38, № 3, с. 553-558
ДРУГИЕ ПРОБЛЕМЫ
УДК 577.217.3:576.858.8:577.2.06
РНК-СВЯЗЫВАЮЩИЕ СВОЙСТВА БЕЛКОВ КЛОСТЕРОВИРУСА
ЖЕЛТУХИ СВЕКЛЫ
© 2004 г. Т. Ю. Тилькунова1, Р. А. Зиновкин, А. А. Аграновский*
Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, Москва, 119992 1Центр "Биоинженерия" Российской академии наук, Москва, 117312 Поступила в редакцию 09.12.2003 г.
Очищенные рекомбинантные белки p64, р65, р24, р22, р21 клостеровируса желтухи свеклы, а также фрагменты pcp, hel, mtr и pol белков, кодируемых репликативными генами этого вируса, тестировали на наличие способности связывать РНК. Методом Норт-Вестерн-блотинга РНК-связывающие свойства обнаружены у белка р64 и 21 кДа фрагмента hel домена хеликазы c консервативными мотивами V и VI. Методом сдвига в полиакриламидном геле показано, что hel связывает РНК со случайной нуклеотидной последовательностью in vitro, причем характер образования комплексов указывает на кооперативность этого взаимодействия. Комплексы РНК-hel стабильны при высокой ионной силе раствора.
Ключевые слова: РНК-содержащий вирус, клостеровирус желтухи свеклы, РНК-белковые взаимодействия, Норт-Вестерн-блотинг, метод сдвига в геле.
Важнейшие функции жизненного цикла вирусов с (+)РНК-геномом, связанные с репликацией, рекомбинацией, регуляцией экспрессии генов и формированием вирионов, определяются способностью вирусных белков связываться с РНК. Кроме белков и белковых доменов, определяющих специфические взаимодействия с геномной РНК (формирование вирионов и репликацию "своей" РНК), у РНК-содержащих вирусов есть несколько типов белков, способных связывать нуклеиновые кислоты неспецифично по отношению к последовательности нуклеотидов. У вирусов растений это, во-первых, РНК-связывающие белки, осуществляющие ближний и дальний транспорт вирусной инфекции по растению [2-6] и, во-вторых, белки, участвующие в транс-активации и регуляции синтеза вирусных РНК и подавлении посттранскрипционного умолкания генов [7-12]. Кроме того, обнаружена РНК-связы-вающая активность домена РНК-хеликазы (hel) тимовируса желтой мозаики турнепса (ВЖМТ, Turnip yellow mosaic virus) [13]. Активность тестировали на нитроцеллюлозных мембранах с перенесенными белковыми фрагментами (Норт-Вес-терн блотинг) [14]. Ранее в литературе данных о способности этого или родственных репликатив-
ных белков связывать РНК в растворе, а также о параметрах связывания, не сообщалось.
Вирус желтухи свеклы (ВЖС, Beet yellows virus) является типичным представителем рода Closterovirus (семейство Closteroviridae), объединяющего переносимые насекомыми нитевидные вирусы растений [15]. Геномная РНК ВЖС состоит из 15480 н. и кодирует 8 белков (рис. 1). Репли-кативные белки, образующиеся в результате трансляции ОРТ 1а и 1b, содержат домены метил-трансферазы (mtr), РНК-хеликазы и РНК-поли-меразы (pol), консервативные у всего суперсемейства Синдбис-подобных вирусов [16, 17]. После-
ОРТ 1а Л-РСР MTR
HEL
2
1b 3
4 6 8 5 7
p64 p22p21
ВЖС
0 i
11 и
Принятые сокращения: БСА - бычий сывороточный альбумин; ВЖС - вирус желтухи свеклы; ОРТ - открытая рамка трансляции; ПААГ - полиакриламидный гель, ВЖМТ - вирус желтой мозаики турнепса; ПЦР - полиме-разная цепная реакция; фрагменты доменов: рср - папаин-подобной протеиназы, mtr - метилтрансферазы, hel - хеликазы, pol - полимеразы; GST - глутатион-^-трансфераза.
*Эл. почта: aaa@genebee.msu.su
POL p65 p24 p20
Рис. 1. Схема строения генома ВЖС, демонстрирующая открытые рамки трансляции для лидерной протеиназы (Л-PCP), предполагаемых доменов метилтрансферазы (MTR), РНК-хеликазы (HEL), РНК-зависимой РНК-полимеразы (POL) и структурных белков, р65 - гомолога клеточных шаперонов семейства HSP70, р64, р24, р22, р21 - фактора дальнего транспорта и белка р20. Клонированные и использованные в данной работе фрагменты кДНК генома ВЖС обозначены черными прямоугольниками. Цифры сверху -номера ОРТ.
довательности аминокислот папаин-подобной протеиназы и белков, участвующих в транспорте и формировании вирионов (р6, р65, р64, р24 и р22), консервативны на уровне данного вирусного семейства; кроме того, в геноме ВЖС закодированы уникальные белки р20 и р21 [16, 18, 19].
Цель настоящей работы - исследование РНК-связывающей активности in vitro белка р64 и фрагмента хеликазы ВЖС (hel), выделенных из клеток бактериального суперпродуцента с помощью аффинной хроматографии.
УСЛОВИЯ ЭКСПЕРИМЕНТА
Экспрессирующие клоны генов ВЖС и получение рекомбинантных белков. Для получения белков ВЖС, несущих на N-конце последовательность, состоящую из шести гистидинов (His6), использовали следующие векторные конструкции: pQE-BYVCP и pQE-BYVp24, несущие гены, соответственно, мажорного (р22) и минорного (р24) белков оболочки [20]; pQE-N6H-p65 (белок р65) [21], pQE-BYVp21 (р21) [1]. Для экспрессии фрагментов генов, кодирующих домены метил-трансферазы и хеликазы (mtr и hel), использовали клоны pQE-N6H-mt и pQE-N6H-hel [22]. Ген белка р64 ВЖС амплифицировли с помощью полиме-разной цепной реакции (ПЦР) с использованием в качестве матрицы кДНК-клона ВЖС D22 [17] с праймерами: pr64(+) 5 '-dA AAAGTTCCCATGGC-GACGACGCGGTTCTC AACTC-3' (соответствующий позициям 11303-11336 в геномной последовательности ВЖС, сайт рестрикции NcoI подчеркнут) и pr64(-) 5'-dTAAGATCTGTGTTTTCGGTGAA-GTGG-3' (комплементарный позициям 12952-12979, сайт рестрикции BglU подчеркнут). Реакцию ПЦР проводили, как описано ранее [1]. Продукт ПЦР клонировали между сайтами NcoI и Bg/II в плазмиде pQE-60. Выделение рекомбинантных белков из клеток Escherichia coli М-15 с помощью аффинной хроматографии на Ni-NTA-агарозе осуществляли по стандратным методикам [22, 23].
Для экспрессии фрагмента гена РНК-полимеразы ВЖС, содержащего консервативные домены III-VIII, была получена конструкция pGEX-POL36 [17]. ДНК клона D36 [17] обрабатывали рестриктазой HindIII, после чего затупляли концы вставки и вырезали ее по сайту EcoRI. Фрагмент размером 720 п. н. (позиции 8472-9179 в геномной последовательности ВЖС) клонировали в вектор pGEX-4T3 ("Amersham Pharmacia Biotech") по сайтам EcoRI и SmaI. Экспрессию гена лидерной протеиназы ВЖС (лишенной 30 N-концевых остатков) осуществляли с помощью клона pGEX-1521. Для его создания фрагмент ДНК, полученный рестрикцией клона pGEM-1520 [17] по сайтам EcoRI и XmaIII, клонировали в плаз-миду pGEX-4T1. Полученными конструкциями трансформировали компетентные клетки BL-21.
Слитые с глютатион-Б-трансферазой (GST) pcp и pol ("слитые белки") выделяли с помощью аффинной хроматографии на глютатион-Б-агарозе, как описано ранее [24, 25].
Анализ РНК-связывающих свойств белков ВЖС, иммобилизованных на нитроцеллюлозной мембране (Норт-Вестерн блотинг) проводили согласно методике, описанной ранее [14]. Для получения РНК-зонда 1.3 мкг очищенной вирионной РНК ВЖС кипятили на водяной бане 3 мин, охлаждали во льду, после чего метили по 5'-концу в реакции с Т4-полинуклеотидкиназой ("MBI Fermentas") и [у-32Р]-АТР (Обнинск). Меченую РНК дважды переосаждали этиловым спиртом в присутствии 2 М ацетата аммония и растворяли в 50 мкл воды.
Фракции очищенных белков после элюции с Ni-NTA-агарозы буфером Е (рН 4.5) с 8 М мочевиной [24] разделяли в 12.5%-ном полиакрила-мидном геле (ПААГ) в денатурирующих условиях [26], после чего белки иммобилизовали на нитроцеллюлозной мембране Hybond-C extra ("Amersham") методом полусухого переноса при 40 В в течение 1.5 ч. Затем мембраны инкубировали в течение 20 ч при 20°С в 10 мл ренатурирующего буфера, содержащего 10 мМ HEPES, рH 7.9, 40 мМ KCl, 5% глицерина, 0.2% Nonidet p40, 3 мМ MgCl2, 0.1 мМ EDTA, 5 мг/мл БСА и 1 мМ дитио-треита [14]. После ренатурации блоты переносили в 10 мл буфера для связывания, содержащего 10 мМ HEPES, рH 7.9, 150 мМ KCl, 8% глицерина, 5 мМ MgCl2, 0.2 мМ дитиотреита, меченый РНК-зонд (3 х 106 имп/мин). В некоторых опытах в инкубационную смесь добавляли также 50 мг/мл тРНК. Инкубацию проводили в течение 2 ч при 25°С, после чего мембраны трижды отмывали в буфере для связывания без дитиотреита и тРНК, высушивали и подвергали радиоавтографии. Соотношение белков на мембране оценивали по окрашиванию параллельно полученного блота красителем Понсо-C ("ДИА-М").
Приготовление РНК-зонда, содержащего случайную последовательность нуклеотидов. В качестве матрицы для создания популяции РНК, содержащих случайную последовательность нуклеотидов, использовали ДНК-конструкцию, полученную с помощью ПЦР с олигодезоксирибонуклеотидами Sel-30N (5 '-dGCCGGATCCGCCTCATGTC-
GAC(N30)TTGAGCGTTTATTCTGAGCTCCC-3', где N = G, A, T, или С), Sel-2 (5'-dCCGAAGCT-TAATACGACTCACTATAGGGAGCTCAGAATAA-ACGCTCAA-3', последовательность Т7-промото-ра выделена курсивом) и Sel-3 (5'-GCCGGATC-CGCCTCATGTCGAC-3'). ПЦР повторяли в течение 18 циклов (94°С - 20 с, 68°С - 30 с, 72°С - 30 с). Реакцию транскрипции in vitro проводили с использованием набора RiboMAX Large Scale RNA Production Systems ("Promega") по методике фир-
РНК-СВЯЗЫВАЮЩИЕ СВОЙСТВА БЕЛКОВ
555
мы-производителя. РНК-транскрипты очищали с помощью электрофореза в 8%-ном ПААГ, содержащем 7 М мочевину, экстрагировали из геля раствором 7.5 М ацетата аммония, содержащим 100 мМ EDTA, рН 8.0, 100 мМ MgCl2, 10 мкг гликогена, после чего осаждали двумя объемами этилового спирта. 32Р-мечение РНК проводили, как описано выше.
Исследование РНК-связывающих свойств препаратов растворимых белков ВЖС методом сдвига в геле. Фракции белков ВЖС в 8 М мочевине диализовали против дистиллированной воды в течение 1.5 ч, после чего аликвоты объемом 10 мкл хранили при -70°С. Слитые с GST белки выделяли в нативном состоянии и хранили в тех же условиях. Концентрацию белка определяли с помощью набора BCA protein assay reagent ("PIERCE"), согласно протоколу фирмы-производителя.
Белки в концентрации 5-100 мкг/мл инкубировали в течение 20 мин при 20°С в 14 мкл буфера R (20 мМ HEPES рН 7.9, 1 мМ EDTA, 1 мМ дитиотреита, 1 мг/мл БСА, 10%-ный глицерин, 5 мМ MgCl2), содержащего различные концентрации (0-500 мМ) NaCl, с 25 нг меченого РНК-зонда. После инкубации реакционную смесь разделяли электрофорезом в
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.