БИОХИМИЯ, 2006, том 71, вып. 9, с. 1253 - 1259
УДК 577.212.3
РНК-ЗАВИСИМАЯ РНК-ПОЛИМЕРАЗА ВИРУСА ГЕПАТИТА С: ИССЛЕДОВАНИЕ МЕХАНИЗМА ИНГИБИРОВАНИЯ ПРОИЗВОДНЫМИ ПИРОГАЛЛОЛА*
© 2006 г. М.В. Козлов**, К.М. Поляков, А.В. Иванов, С.Е. Филиппова, А.О. Кузякин, В.Л. Туницкая, С.Н. Кочетков
Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН, 119991 Москва, ул. Вавилова, 32; факс: (495)135-1405, электронная почта: kozlovmv@hotmail.com
Поступила в редакцию 22.03.06 После доработки 29.03.06
Обнаружено, что пирогаллол обратимо и неконкурентно ингибирует активность РНК-зависимой РНК-по-лимеразы вируса гепатита С. Молекулярное моделирование связывания ингибитора в активном центре фермента дает основание полагать, что механизм ингибирования заключается в хелатировании двух двухвалентных катионов магния, принимающих участие в каталитическом акте на стадии переноса фосфорильно-го остатка. Предложенная модель позволила осуществить направленный синтез новых производных, отличающихся более высокой ингибирующей способностью.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: вирус гепатита С, РНК-зависимая РНК-полимераза, производные пирогаллола, механизм ингибирования, молекулярное моделирование.
Вирус гепатита С принадлежит к числу наиболее широко распространенных человеческих патогенов. В настоящее время ~3% мирового населения (170 млн.) инфицировано ВГС [1, 2]. У значительного числа инфицированных в течение ~20 лет развивается цирроз печени с возможным последующим развитием гепатоцеллю-лярной карциномы [3]. Современная терапия гепатита С основана почти исключительно на использовании интерферона а, а также его комбинации с нуклеозидным аналогом — рибавири-ном [4]. Следует отметить крайне низкую эффективность такой терапии, особенно в отношении вируса первого генотипа, наиболее распространенного в России (чувствительными к терапии оказываются <30% пациентов).
При разработке новых подходов к терапии гепатита С одной из наиболее привлекательных мишеней является РНК-зависимая РНК-поли-мераза ВГС (вирусный белок N856), поскольку
Принятые сокращения: ВГС — вирус гепатита С, RdRp — РНК-зависимая РНК-полимераза, DKA — 2,4-ди-оксо-4-фенилбутановая кислота, CN-DKA — 4-[2-(3-циа-нопропокси)фенил]-2,4-диоксобутановая кислота, Pyr — пирогаллол, CN-Pyr — цианоацетилгидразон 5-формилпи-рогаллола. IC50 — концентрация 50% ингибирования.
* Первоначально английский вариант рукописи был опубликован на сайте «Biochemistry» (Moscow), Papers in Press, BM 06-072, 11.06.2006.
** Адресат для корреспонденции и запросов оттисков.
в норме клетка печени не содержит белков, обладающих аналогичной активностью. ЯёЯр ВГС является ключевым компонентом реплика-ционного комплекса ВГС и представляет собой белок с молекулярной массой ~70 кДа, структурно родственный с другими односубъединичными РНК- и ДНК-полимеразами вирусов и бактерий [5]. Известные в настоящее время ингибиторы ЯёЯр можно условно разделить на два основных класса: производные нуклеозидов и ненуклео-зидные ингибиторы различной природы [6, 7]. Среди последних особое место занимают производные а,у-дикетокислот, в частности 2,4-ди-оксо-4-фенилбутановая кислота (рис. 1, а).
Структурной особенностью БКЛ является компланарное расположение трех кислородсодержащих функциональных групп, сопряженных с ароматическим фрагментом молекулы. Существует предположение, что эти группировки хелатируют ионы магния, присутствующие в активном центре ЯёЯр ВГС и других односубъ-единичных РНК-и ДНК-полимераз и принимающие участие в катализе образования межнук-леотидной связи [8—11]. Поскольку в обычных условиях ферментативной реакции с этими ионами взаимодействует пирофосфатный фрагмент привходящего N7?, такого рода ингибиторы можно считать миметиками пирофосфата [8, 9]. Считается, что хелатирование кислородсодержащими группами БКЛ ионов магния активно-
Рис. 1. Общие формулы производных БКА (а) и синтезированных 5-замещенных производных пирогаллола (б). Кислородсодержащие лиганды отмечены стрелками
го центра препятствует связыванию пирофос-фатной группировки нуклеотидного субстрата и, тем самым, образованию фосфодиэфирной связи, в то время как заместители ароматического кольца (Я) существенно влияют на специфичность и эффективность взаимодействия с ферментом [9]. Следует отметить, однако, что ряд экспериментально установленных фактов, прежде всего неконкурентный характер ингибирова-ния по отношению как к нуклеозидтрифосфату, так и к РНК-матрице, противоречит предложенному механизму [6, 8]. Таким образом, для определения реального механизма ингибирова-ния требуются дополнительные биохимические и структурные исследования.
Тот факт, что описанные нами ранее производные пирогаллола также содержат соответствующие кислородсодержащие лиганды (рис. 1, б) и ингибируют ЯёЯр ВГС обратимо и неконкурентно относительно МТР [12], позволил предположить, что эти соединения могут действовать аналогично.
МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
В работе использовались следующие реактивы: пирогаллол («Acros Organics», Бельгия), 5-формилпирогаллол («Aldrich», США), Escherichia coli, штамм BL-21-CodonPlus® (DE3) — RIL («Stratagene», США), Ni-NTA-агароза («Novagen», США), поли(и)-сефароза CL-6B («Amersham», Англия), бактотриптон и дрожжевой экстракт («Difco», США), Tris и 2-меркапто-этанол («Merck», Германия), глицерин, дитио-треитол, имидазол, Triton X-100, нонидет P-40, персульфат аммония, фенилметилсульфонил-фторид (ФМСФ) и лейпептин («Sigma», США), ЭДTA и пепстатин («Serva», Германия). Остальные реактивы были марок ос.ч. или х.ч. («Реа-хим», Россия).
Синтез производных пирогаллола. Замещенные производные пирогаллола 1—7 получали в одну стадию, исходя из 5-формилпирогаллола и соответствующего аминосоединения (схема). Общая методика синтеза состояла в следующем. К раствору 5-формилпирогаллола моногидрата (86 мг, 0,5 ммоль) в 1,0 мл этанола добавляли 1,2 эквивалента состава аминокомпоненты и AcOH (30 мг, 0,5 ммоль). После 2—3 ч инкубации при комнатной температуре продукт выделяли посредством фильтрования или с помощью хроматографии. Выходы продуктов составляли 50—85%. Структуру полученных соединений подтверждали c помощью спектров 1H ЯМР (DMSO-d6) и в ряде случаев масс-спектромет-рически (ESI MS).
Данные ЯМР и ESI MS для полученных соединений 1—7:
1 - 8 9,20 (s, 2H, OH), 8,79 (s, 1H, OH), 8,26 (s, 1H, CH), 7,37 (t, J = 8,1 Гц, 2H, CH), 7,19 (t, J= = 8,1 Гц, 3H, CH), 6,89 (s, 2H, CH);
2 - (cys, E) 8 10,95 (s, 1H, NH), 9,08 (s, 2H, OH), 8,55 (s, 1H, OH), 7,70 (s, 1H, CH), 6,58 (s, 2 H, CH), 2,15 (s, 3H, CH3); (trans, E) 8 11,08 (s, 1H, NH), 9,08 (s, 2H, OH), 8,55 (s, 1H, OH), 7,84 (s, 1H, CH), 6,62 (s, 2H, CH), 1,90 (s, 3H, CH3);
3 - 8 9,07 (s, 2H, OH), 8,54 (s, 1H, OH), 7,91 (s, 1H, CH), 6,55 (s, 2H, CH), 3,80 (s, 3H, CH3);
4 - 8 8,90 (s, 2H, OH), 8,25 (s, 1H, OH), 7,44 (s, 1H, CH), 6,54 (s, 2H, CH), 3,73 (t, J = 4,7 Гц, 4H, CH2), 2,99 (t, J = 4,7 Гц, 4H, CH2);
5 - 8 8,91(s, 4H, OH), 8,27 (s, 2H, OH), 7,47 (s, 2H, CH), 6,56 (s, 4H, CH), 3,17 (s, 8H, CH2);
6 - (cys, E) 8 11,50 (s, 1H, NH), 9,12 (s, 2H, OH), 8,65 (s, 1H, OH), 7,72 (s, 1H, CH), 6,61 (s, 2H, CH), 4,11 (s, 2H, CH2); (trans, E) 8 11,44 (s, 1H, NH), 9,14 (s, 2H, OH), 8,64 (s, 1H, OH), 7,86 (s, 1H, CH), 6,66 (s, 2H, CH), 3,74 (s, 2H, CH2); ESI MS: m/e C10H9N3O4 236,1 [M + H]+;
7 - (cys, E) 8 7,65 (s, 1H, CH), 6,56 (s, 2H, CH), 2,99 (s, 2H, CH2); (trans, E) 8 12,93 (s, 1H, NH), 9,06 (s, 1H, OH), 7,84 (s, 1H, CH), 6,64 (s, 2H, CH), 2,81 (s, 2H, CH2); ESI MS m/e C10H9N2O6K 293,1 [M + H]+.
он он
Ho i^ OH но 1 он
fl ^Г^ NH- R, YT
EtOH/AcOH, 25°, 2-3 ч У
Н^О Л- н NvwR,
Общая схема синтеза 5-замещенных производных пирогаллола 1—7
Ингибирование RdRp ВГС производными пирогаллола. Выделение RdRp ВГС и определение ее активности проводили по методикам, описанным в нашей предыдущей работе [12]. Значения IC50 для ингибиторов определяли согласно методике, описанной в работе [12], в интервале концентраций 0,3 мкМ — 1 мМ. Ингибиторы вносили в реакционную смесь после преинкуба-ции вместе с UTP. Ошибка измерения IC50 составляла 10—20% в результате четырех параллельных опытов.
Молекулярное моделирование и докинг проводили на рабочей станции «Indigo 2» (Silicon Grafios) с использованием программ Turbo Frodo [13] и Molscript [14].
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
В этой работе мы искали ответ на вопрос, почему миметики пирофосфата демонстрируют неконкурентный по отношению к NTP характер ингибирования RdRр. Мы предположили, что это явление связано с особенностями полиме-разной реакции. Известно, что все односубъ-единичные ДНК- и РНК-полимеразы в процессе цикла удлинения полинуклеотидной цепи на одно звено совершают переход от «открытой» к «закрытой» конформации, которые соответствуют каталитически неактивному и активному состояниям комплекса. Согласно общепринятой точке зрения в открытой конформации происходит связывание NTP в так называемом «преинсерционном» центре (центр первичного связывания), расположенном в канале входа NTP на некотором расстоянии от каталитического центра. Последующий переход к закрытой конформации сопровождается перемещением NTP в «инсерционный» центр (собственно каталитический центр) [15]. Для осуществления следующего цикла присоединения нуклеотида фермент должен возвратиться к открытому состоянию.
Детальный кинетический и термодинамический анализ реакции, катализируемой RdRр ВГС, проведен не был. Однако такой анализ был выполнен для близкородственной полимеразы полиовируса 3D, и есть веские основания полагать, что большая часть РНК-зависимых РНК-полимераз вирусов животных действуют по одинаковому механизму [16, 17]. Согласно этим данным в процессе элонгационного цикла две стадии являются частично скоростьлимитирую-щими, а именно переход от открытой к закрытой конформации, предшествующий переносу фосфорила, и сам перенос на З'-конец растущей полинуклеотидной цепи [16, 17]. Очевидно, что
миметики пирофосфата могут оказывать влияние преимущественно именно на эти скорость-лимитирующие стадии. Исходя из этого, можно предложить два возможных варианта объяснения механизма наблюдаемого неконкурентного типа ин
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.