БИОХИМИЯ, 2009, том 74, вып. 8, с. 1028 - 1036
УДК 511.113
РНК-ЗАВИСИМАЯ РНК-ПОЛИМЕРАЗА ВИРУСА ГЕПАТИТА С: ИЗУЧЕНИЕ ИНГИБИРОВАНИЯ ПРОИЗВОДНЫМИ а,у-ДИКЕТОКИСЛОТ*
© 2009 г. М.В. Козлов**, К.М. Поляков, С.Е. Филиппова, В.В. Евстифеев, Г.С. Людва, С.Н. Кочетков
Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН, 119991 Москва, ул. Вавилова, 32; факс: (495)135-1405, электронная почта: kozlovmv@hotmail.com
Поступила в редакцию 10.11.08 После доработки 02.04.09
а,у-Дикетокислоты (БКАб), как полагают, подавляют активность РНК-зависимой РНК-полимеразы вируса гепатита С за счет комплексообразования с каталитическими ионами М^2+ в активном центре фермента. Однако а,у-дикетокислоты демонстрируют неконкурентный тип ингибирования по отношению к МТР-субстрату, что противоречит предложенному механизму. Мы исследовали канал входа МТР-субстрата и активный центр РНК-зависимой РНК-полимеразы вируса гепатита С на предмет возможного взаимодействия с а,у-дикетокислотами. Замены Я48А, К51А и Я222А многократно усиливали ингибирующее действие а,у-дикетокислот и одновременно с этим увеличивали значения Кт иТР-субстрата. Интересно, что замена С223А единственная среди прочих снижала значение Кт(иТР), но также повышала эффективность ингибирования. Полученные результаты позволили смоделировать комплекс фермента с ингибитором. Согласно предложенной модели а,у-дикетокислоты привносят дополнительный ион М^2+ в активный центр фермента на стадии образования фосфодиэфирной связи, в результате чего происходит смещение трифосфатного остатка МТР-субстрата в каталитически неактивную моду связывания. Данный механизм, в отличие от принятого, в настоящее время объясняет неконкурентный тип ингибирования.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: вирус гепатита С, РНК-зависимая РНК-полимераза, производные а,у-дикетокис-лот, механизм ингибирования, молекулярное моделирование.
В результате скрининга комбинаторной библиотеки из 200 тысяч соединений группой итальянских исследователей было обнаружено, что 2,4-диоксо-4-фенилбутановая кислота (БЕЛ, рис. 1) действует как селективный и обратимый ингибитор РНК-зависимой РНК-полимеразы вируса гепатита С (ЯёКР, вирусный неструктурный белок N855) [1]. По данным тех же авторов ингибирование являлось неконкурентным по отношению к NTP-субстрату и РНК-матрице. Сравнивая действие БКА и аналога пирофосфа-та — фоскарнета, они также обнаружили, что оба вещества конкурируют за общий центр связывания в активном центре ЯёЯР [2]. На основании этого авторы предложили считать дикетокисло-
Принятые сокращения: RdRP HCV — РНК-зависимая РНК-полимераза вируса гепатита С; DKAs — а,у-дике-токислота, DKAs — орто- и мета-производные а,у-дике-токислот.
* Первоначально английский вариант рукописи был опубликован на сайте «Biochemistry» (Moscow), Papers in press, BM 08-348, 21.06.2009.
** Адресат для корреспонденции и запросов оттисков.
ты аналогами пирофосфата. По их гипотезе ди-анион енольной формы а,у-дикетокислот (БКАз) образует комплексную связь с ионом М^2+ или Мп2+, присутствующим в активном центре фермента, что, в свою очередь, предотвращает связывание NTP-субстрата и образование фосфо-диэфирной связи. В соответствии с этим механизмом ароматическая компонента ингибитора отвечает за специфичность и силу дополнительных взаимодействий с центром связывания [3].
Следует заметить, что допускаемая авторами конкуренция между NTP-субстратом и БКА за хелатирование одних и тех же каталитических ионов магния никак не соответствует ими же обнаруженному неконкурентному типу ингиби-рования. Очевидно, что механизм действия ди-кетокислот является более сложным и требует дальнейшего изучения. Недавно по этому вопросу было высказано утверждение, что при переходе от стадии инициации к стадии элонгации БКА меняют тип ингибирования по отношению к NTP-субстрату с неконкурентного на конкурентный [4]. К сожалению, подробное описание экспериментов и их результатов авто-
Рис. 1. Молекулярная структура БКЛ, представленная в енольной форме, и перечень соединений, использованных в работе, с указанием заместителей
рами не приводится, что затрудняет их критический анализ. Скорее всего, они указывают на то, что центры связывания МТР-субстрата и БКЛ имеют общие границы, которые, вероятно, начинают перекрываться при структурных перестройках активного центра.
Несмотря на большое разнообразие синтезированных структурных вариантов БКЛз, до сих пор остается неясным, как БКЛ связываются с ферментом. Первые предположения, на этот счет были высказаны корейскими исследователями в 2006 году [5]. Используя кристаллическую структуру необычного комплекса ЯёЯР с тремя молекулами иТР [6] и отдаленное структурное сходство между БКЛ и иТР, авторы предложили модель взаимодействия ингибитора и фермента. Она включала в себя:
— электростатическое взаимодействие дике-токислотного остатка с каталитическим ионом Мп2+;
— водородную связь с РИе224 и Лзр225;
— водородную связь с Leu159. Как видно, данная модель находится в русле идей, высказанных первооткрывателями БКЛ [2].
В предыдущей работе [7] мы получили первые указания на то, что ингибирующее действие БКЛ может осуществляться при взаимодействии с полностью сформированным каталитическим комплексом на стадии образования фос-фодиэфирной связи. Мы предположили также, что остаток Л^222 усиливает взаимодействие фермента с ингибитором за счет образования дополнительной водородной связи. В этом сообщении мы представляем дальнейшие результаты по локализации центра связывания БКЛз, полученные на основании олигонуклеотидна-правленного мутагенеза активного центра ЯёЯР.
МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Синтез производных DKA. Производные DKA (рис. 1) были синтезированы в соответствии с опубликованными методиками [1, 8]. Структуру полученных соединений подтверждали c помощью спектров 1Н-ЯМР (DMSO-d6). Ниже приведены неопубликованные ранее спектры ЯМР для соединений:
DKA-PrCO2H - 8 7,81 (d, J = 6,9 Гц, 1Н, CH), 7,60 (t, J = 7,2 Гц, 1Н, CH), 7,26 (s, 1Н, CH), 7,20 (d, J = 8,4 Гц, 1H, CH), 7,10 (t, J = 7,6 Гц, 1H, CH), 4,15 (t, J = 6,2 Гц, 2H, CH2), 2,46 (t, J = 7,5 Гц, 2H, CH2), 1,96-2,05 (m, 2H, CH2);
DKA-BnCO2H - 8 7,94 (d, J = 7,8 Гц, 1H, CH), 7,64-7,70 (m, 2H, CH), 7,57-7,63 (m, 2H, CH), 7,43-7,52 (m, 2H, CH), 7,30 (d, J = 8,1 Гц, 1H, CH), 7,02 (s, 1H, CH), 5,53 (s, 2H, CH2).
Экспрессия и очистка RdRP. Для экспрессии RdRP, укороченной на 55 аминокислотных остатков с С-конца, использовали плазмиду pET-21d-2c-5BA55, сконструированную нами ранее [9]. Направленный мутагенез гена RdRP был выполнен с использованием набора QuickChange («Stratagene», США) в соответствии с прилагаемым протоколом. Последовательности прямых (F) и обратных (R) праймеров для получения единичных замен аминокислот (R48A, K51A, Q148A, K151A, R222A, C223A и D352A) приведены в табл. 1. ПЦР проводили в следующем режиме: предварительный нагрев 30 с - 95° и далее 16 циклов в режиме: при 95° - 30 с, 1 мин - 55°, 68° - 7 мин 20 с. Все замены в нужных положениях были подтверждены сиквенированием.
Полученные мутантные плазмиды были использованы для трансформации E. coli линии Rosetta (DE3). После индукции экспрессии фер-
Таблица 1. Структуры праймеров для направленного мутагенеза NS5bA55
Мутация Прямой (F) и обратный (R) праймеры
R48A F 5' GCAGCGCAAGCCTGGCGCAGAAGAAGGTCACC 3' R 5' GGTGACCTTCTTCTGCGCCAGGCTTGCGCTGC 3'
K51A F 5' GCCTGCGGCAGAAGGCGGTCACCTTTGACAGACTG 3' R 5' CAGTCTGTCAAAGGTGACCGCCTTCTGCCGCAGGC 3'
Q148A F 5' GAGGTTTTCTGCGTCGCGCCAGAGAAGGGGGGC 3' R 5' CGGCCCCCCTTCTCTGGCGCGACGCAG 3'
K151A F 5' CTGCGTCCAACCAGAGGCTGGGGGCCGC 3' R 5' GCTTGCGGCCCCCAGCCTCTGGCGC 3'
R222A F 5' GCTTCTCATATGACACCGCATGCTTTGACTCAACAGTCACTG 3' R 5' TCAGTGACTGTTGAGTCAAAGCATGCGGTGTCATATGAGAAGCCC 3'
C223A F 5'GGCTTCTCATATGACACCCGGGCCTTTGACTCAACAGTCACTG 3' R 5' CAGTGACTGTTGAGTCAAAGGCCCGGGTGTCATATGAGAAGCC 3'
D352A F 5' CCCCCTGGGGCCCCGCCCCAACCAGAATAC 3' R 5' GTATTCTGGTTGGGGCGGGGCCCCAGGGGG 3'
мент был очищен на колонке с Ni-NTA-агаро-зой, как это было описано ранее [9]. Целевые фракции были диализованы при 4° против буфера, содержащего 20 мМ Tris (pH 7,5), 30% глицерина, 350 мМ NaCl, 1мМ ЭДТА и 10 мМ 2-мер-каптоэтанола, и хранились при —20°.
Определение полимеразной активности. Стандартная реакционная смесь содержала 0,3 мкг RdRP, 100 мкг/мл poly(rA), 25 мкг/мл (Up)5U, 10 мкМ UTP и 1 мкCi [a-32P]UTP в 20 мкл буфера, содержавшего 20 мМ Tris (pH 7,5), 20 мМ KCl, 4 мМ МяС12, 1 мМ ЭДТА, 1 мМ DTT и 0,1 мг/мл БСА. Предварительную инкубацию фермента с poly(rA) и (Up)5U проводили в течение 15 мин при 20°, после чего добавляли UTP и [a-32P]UTP и инкубировали еще 30 мин при 30°. Затем 10 мкл реакционной смеси переносили на фильтр DE-81, который отмывали четыре раза 0,5 М PBS (pH 7,0), один раз этиловым спиртом, и сушили на воздухе. Радиоактивность фильтров измеряли по Черенкову.
Значения Km (UTP) определяли в интервале концентраций UTP 1—500 мкМ и рассчитывали с помощью программного обеспечения Origin 6.1 (OriginLab Corp.) в кинетической модели Миха-элиса—Ментен. Ошибка измерения Km (UTP) составляла 20% в результате трех параллельных опытов.
Измерение ингибирующего действия DKA.
Полимеразную реакцию проводили в присутствии ингибиторов в интервале концентраций 0,1—300 мкМ, для чего производные DKA первоначально растворяли в DMSO, затем смешивали с водным раствором UTP/[a-32P]UTP и добавляли к реакционной смеси после предварительной инкубации фермента с матрицей и праймером, как было описано выше. Ошибка измерения IC50 составляла 10—20% по данным четырех параллельных опытов. Тип ингибирова-ния определяли по методу Диксона при концентрациях ингибиторов 1—300 мкМ и трех концентрациях UTP (0,5; 5 и 50 мкМ).
Молекулярное моделирование и докинг проводили на рабочей станции «Indigo 2» (Silicon Grafios) с использованием программ Turbo Frodo [10] и Molscript [11].
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
В предыдущей работе мы предложили механизм ингибирования RdRP производными DKA, в соответствии с которым дикетокислотный остаток ингибитора тремя атомами кислорода хе-латирует два иона Mg2+ в составе каталитического комплекса на стадии перенос
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.