БИОХИМИЯ, 2008, том 73, вып. 3, с. 293 - 302
УДК 557.157.2
РОЛЬ А-ЦЕПИ В ФУНКЦИОНИРОВАНИИ АКТИВНОГО ЦЕНТРА а-ТРОМБИНА ЧЕЛОВЕКА
Обзор
© 2008 г. М.В. Колодзейская, Л.И. Соколовская*, Г.Л. Волков
Институт биохимии им. А.В. Палладина НАНУкраины, 01601 Киев, ул. Леонтовича, 9; факс: 38(044)235-5172, электронная почта: sokludmila@yandex.ru
Поступила в редакцию 12.04.07 После доработки 05.09.07
Представлены современные данные, свидетельствующие о роли А-цепи молекулы а-тромбина как аллосте-рического эффектора в каталитических реакциях с субстратами разного типа. Особое внимание уделено взаимосвязи между структурой А-цепи и каталитической активностью тромбина. Существование этой взаимосвязи основано на изучении природной мутации А-цепи молекулы а-тромбина. Методами молекулярной и эссенциальной динамик подтверждена роль А-цепи в изменении конформации и каталитических свойств фермента, особенно в остатках, расположенных в участках специфичности и в некоторых вставочных петлях. Современные знания о структуре и свойствах тромбина позволят создавать новые антитромби-новые препараты.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: тромбин, аллостерия, мутагенез, протеин С, модуляция, тромбомодулин, молекулярная динамика.
Известно, что тромбин — полифункциональный фермент, участвующий в регуляции процесса свертывания крови и сохранения ее жидкого состояния, тем самым проявляющий про-коагулянтные, антикоагулянтные и антифибри-нолитические свойства. Полифункциональность тромбина сочетается с высокой избирательностью расщепляемых связей [1—3] и, несомненно, обусловлена внутренней структурой фермента и функциональными группировками, расположенными на поверхности его молекулы. Отметим, что фундаментальные исследования особенностей строения, функционирования и назначения основных структурных элементов тромбина ведут к пониманию их структурно-функциональных взаимоотношений и тем самым определяют базу для создания новых препаратов антитромбинового действия [4—13]. Исследование кристаллической структуры а-тром-бина показало, что поверхность молекулы может быть подразделена на несколько функцио-
Принятые сокращения: МД — молекулярная динамика; ЭД — эссенциальная динамика; PAR1 — рецептор 1, активированный протеиназой; BPTI — основной панкреатический ингибитор тромбина; PPACK — D-Phe-Pro-Арг-метилкетон; a-NAPAP — N-a-17-нафтилсульфонил-гли-цил]-4-амидинофенилаланин-пиперидин.
* Адресат для корреспонденции и запросов оттисков.
нальных участков, узнающих различные субстраты, ингибиторы и медиаторы с высокой специфичностью [11—18].
Рассматривается взаимосвязь между структурой А-цепи и каталитической активностью тромбина и стабильностью последнего, конфор-мационными перемещениями групп активного центра фермента, вызванными связыванием с его молекулой. Изучение этой проблемы важно и актуально, так как получены новые данные, свидетельствующие о роли А-цепи как аллостерического эффектора а-тромбина в каталитическом процессе [2, 8, 10, 14—18].
Интерес к роли А-цепи, с одной стороны, вызван поисками структурного элемента молекулы тромбина, ответственного за высокую селективность гидролиза при действии на физиологические высокомолекулярные субстраты, и, с другой стороны, связан с изучением особенностей функционирования активного центра фермента.
Отметим, что не все сериновые протеиназы имеют А-цепь в составе молекулы. Очень короткая (13 аминокислотных остатков) А-цепь хи-мотрипсина не выполняет определенной функции, а трипсин вообще не обладает этой цепью. В то же время для нескольких факторов гемостаза — калликреина, фактора XI, плазмина — обнаружено, что их физиологическая специфич-
ность обусловлена дополнительными участками связывания, расположенными на второй, легкой некаталитической цепи [3, 19—24]. А-Цепь тромбина имеет бумерангоподобную форму с рядом изгибов, некоторую спиральную конфигурацию и обволакивает гладкий контур части Б-цепи, расположенный напротив кармана первичного связывания активного центра тромбина [14, 15, 21]. А-Цепь связана с Б-цепью через дисульфидный мостик Cys1—Cys122. Большинство других А— Б-взаимодействий происходит между заряженными боковыми цепями, шесть из которых образуют солевые мостики и участвуют в межцепочечных водородных связях. Внутреннюю стабилизацию А-цепи молекулы тромбина обеспечивают главным образом полярные связи и образование солевых мостиков. Результаты исследований, направленных на выяснение роли А-цепи в каталитическом процессе, были впервые приведены в работах [25, 26]. На основании полученных результатов авторы пришли к выводу, что А-цепь не играет существенной роли в узкой специфичности тромбина. К подобному выводу пришли и авторы работ [27, 28], хотя они предположили, что А-цепь тромбина необходима для нормального функционирования его активного центра, расположенного в Б-цепи. Согласно модели пространственной структуры тромбина А-цепь опоясывает свернутую глобулу Б-цепи, проходя вблизи активного центра. Располагаясь на поверхности Б-цепи, А-цепь может стабилизировать натив-ную конформацию активного центра [3, 27, 28].
Прошло довольно много времени, прежде чем началось детальное интенсивное исследование функции А-цепи а-тромбина и влияния ее на катализ, в основном на проявление его специфичности по отношению к субстратам различных типов. Поводом для этого послужило выявление природного мутанта — а-тромбина с делецией одного из двух смежных лизинов Lys9/Lys10 у двух не состоящих в родстве пациентов из Ирана с тяжелым дефицитом протромбина и геморрагическим диатезом. Дефицит протромбина — аутосомно-рециссивное заболевание, характеризующееся двумя фенотипами: гипопротромбинемией с сопутствующим низким уровнем свертывающей активности и антигенов (тип I) и диспротромбинемией с очень низкой свертывающей активностью, но с субнормальным или нормальным уровнем антигенов (тип II) [22, 24, 29—35]. Для уточнения роли А-цепи тромбина человека был исследован природный мутант (AK9), имеющий делецию аминокислоты Lys9.
Открытие конформационного перехода в тромбине из slow- в fast-форму, индуцированно-
го Na+, позволило предположить важность баланса между прокоагулянтной и антикоагулянт-ной формами тромбина в организме [22, 29, 32]. На основании результатов расчета энергетического распределения остатка лизина, который подвергается делеции в молекуле тромбина, показано, что аллостерическое связывание AK9 с Na+ уменьшается при делеции лизина [22]. Это подтверждается тем фактом, что делеция Lys9 в А-цепи должна вызывать slow-подобную конформацию мутанта тромбина, т.е. его чувствительность к Na+ значительно уменьшается по сравнению с таковой у WT-тромбина. Доказательством этого являются результаты гидролиза субстрата Tos—Gly—Pro—Arg—pNA. Значения Кт были равны 3,62 и 5,50 мкМ для AK9- и WT-тромбинов соответственно, тогда как значения kcat для AK9- и WT-тромбинов составляли 9,34 и 101 с-1 соответственно. Согласно приведенным данным возможные конформационные изменения, вызванные в активном центре тромбина делецией Lys9, могут влиять на промежуточные этапы катализа интенсивнее, чем на связывание, которое, как было показано, более благоприятно для мутанта, чем для WT-фермента [34, 35].
При изучении взаимодействия AK9- и WT-фермента с некоторыми субстратами и рецепторами тромбоцитов (PAR1 — рецептор типа 1, активируемый протеиназами, гликопротеин Iba) было обнаружено [22, 29, 34], что значения kcat/Km гидролиза синтетического субстрата D—Phe—Pip—Arg—pNA и фибринопептида А мутантом AK9 ниже, чем WT-ферментом, в 18 и 60 раз соответственно. При этом значение kcat в реакции гидролиза фибринопептида А уменьшается от 45,3 с-1 (для WT-фермента) до 1,82 с-1 (для мутанта AK9), а значения Кт для этих ферментов составляют 5,1 и 13 мкМ соответственно. Было показано, что AK9 слабо активирует PAR1 тромбоцитов, величина ЕС50 составляет 38,6 нМ (где ЕС50 — концентрация тромбина, способная проактивировать тромбоциты на 50%), тогда как для WT-тромбина ЕС50 = 2,1 нМ. Чтобы исследовать причину этого явления, проведен гидролиз пептида 38—60 PAR1 in vitro и рассчитаны кинетические параметры. Установлено, что kcat/Km уменьшается в 116 раз (от 1,74 • • 107 М-1 • с-1 в WT-форме до 1,5 • 105 М-1 • с-1 в мутантной форме тромбина). Это соответствует изменению свободной энергии активации на 2,8 ккал/моль. В то же время связывание с гли-копротеином Iba не было нарушено (значения Kd для WT- и AK9-тромбина составляют 0,12 и 0,13 мкМ соответственно) [22]. Таким образом, слабая активация тромбоцитов мутантом тромбина в основном связана с нарушением его взаимодействия с PAR1.
При гидролизе протеина С обеими формами тромбина в присутствии 100 нМ тромбомодули-на значение кса1/Кт для мутантного тромбина в 30 раз ниже, чем для ,^Т-формы. Однако значения Кй комплексов тромбин-тромбомодулин оказались практически одинаковыми для двух форм тромбина [22, 29, 32].
При изучении взаимодействия двух форм тромбина с физиологическими и синтетическими ингибиторами получены довольно интересные данные. Эти исследования были проведены в присутствии и в отсутствие гепарина. Обнаружено, что скорость реакции при взаимодействии мутантного тромбина АК9 с антитромбином уменьшилась в 20 раз по сравнению таковой в случае ,^Т-тромбина. Показано, что в отличие от скорости реакции для АК9 таковая для WT-тромбина в присутствии гепарина (75 нМ) резко увеличивается (от 1,3 • 104 до 6,8 • 107 М-1 • с-1). Такое дефектное взаимодействие для мутанта АК9, не зависящее от гепарина, предполагает замедление процессов, приводящих к образованию стабильного комплекса тромбин-антитромбин. Вместе с тем обнаружено высокое сродство мутанта АК9 к ингибитору а-МАРАР (К = 0,66 и 2,1 нМ для АК9- и ,^Т-форм тромбина соответственно). Связывание АК9 с основным панкреатическим ингибитором (ВРТ1) также характеризуется более низким значением Кй по сравнению с таковым для ,^Т-тромбина (40 и 109 мкМ соответственно) [22, 29].
Приведенные данные свидетельствуют о том, что потеря Lys9 в А-цепи отрицательно влияет на каталитические свойства тромбина. По-видимому, конформационные изменения в легкой цепи могут влиять на «щел
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.