УДК 576.311.5;577.352.3+577.23
РОЛЬ АДАПТОГЕНОВ В РЕГУЛЯЦИИ БИОЭНЕРГЕТИЧЕСКИХ ФУНКЦИЙ МИТОХОНДРИЙ В УСЛОВИЯХ СТРЕССА
© 2013 г. И. В. Жигачева1*, Е. Б. Бурлакова1, И. П. Генерозова2, А. Г. Шугаев2
Институт биохимической физики им. Н.М. Эмануэля РАН, 119334, Москва, ул Косыгина, 4;
*электронная почта: zhigacheva@mail.ru 2Институт физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН, 127276, Москва, ул. Ботаническая, 35
Поступила в редакцию 04.03.2013 г.
Изучено влияние пространственно-затрудненных фенолов и регуляторов роста растений (РРР) на интенсивность перекисного окисления липидов (ПОЛ) в мембранах митохондрий. При стрессовых воздействиях интенсивность флуоресценции продуктов ПОЛ в мембранах этих органелл повышается в 3—4 раза. Пространственно-затрудненные фенолы и РРР снижают интенсивность ПОЛ до контрольных значений, что способствует сохранению высокой функциональной активности митохондрий. Предотвращение дисфункции митохондрий сопряжено с повышением устойчивости растительных и животных организмов к действию стрессовых факторов.
Ключевые слова: адаптогены, митохондрии, перекисное окисление липидов, дисфункция митохондрий, стресс.
Б01: 10.7868/80233475513040105
Митохондрии, регулирующие энергетический обмен, играют одну из основных ролей в ответе организма на действие стрессовых факторов. Около 1—3% потребляемого митохондриями кислорода в результате одноэлектронного восстановления образуют активные формы кислорода (АФК), которые участвуют в клеточной редокс-сигнализации. В нормальных условиях стационарный уровень АФК в органах и тканях весьма низок (порядка 10-10—10-11 М), что обусловлено наличием в них ферментативной и неферментативной систем регуляции накопления и устранения АФК. Под действием стрессовых факторов антиоксидантно—прооксидантное равновесие смещается в сторону увеличения продукции АФК, что приводит к развитию ряда патологических состояний [1] в результате повреждения компонентов клетки. АФК способны ингибиро-вать или снижать активность ферментов митохондрий, содержащих Бе-В-кластеры, таких как МЛЭИ-дегидрогеназа (комплекс I), АТР-синтаза (комплекс V), аконитаза [2]. Накопление в этих органеллах Н2О2 может привести к взаимодействию пероксида водорода с Бе2+, что, вероятно, будет способствовать образованию ОН* по реакции Фентона [3]. Взаимодействие ОН* с такими полиненасыщенными жирными кислотами, как линолевая, линоленовая и арахидоновая, входящими в состав липидов мембран, приводит к активации перекисного окисления липидов (ПОЛ). Образование гидрофильных продуктов ПОЛ из-
меняет структуру липидного бислоя мембран в гидрофобных участках. При этом создаются условия для пассивного транспорта ионов и метаболитов, что приводит к нарушению координации и специфичности мембранных процессов (выраженность которых зависит от интенсивности окислительного процесса) [4]. Кроме того, в результате ПОЛ образуются токсичные для клеток растений и животных продукты: альдегиды и 4-гидрокси-2,3-ноненали. Эти соединения инги-бируют ферменты, вовлеченные в основные метаболические пути — в фотодыхание (у растений) и в цикл трикарбоновых кислот, что влияет на транспорт электронов в дыхательной цепи митохондрий за счет истощения пула МЛЭИ в мито-хондриальном матриксе [1]. По этой причине довольно актуальна проблема поиска новых препаратов, обладающих адаптогенными свойствами. При стрессовых воздействиях основным источником АФК в клетках животных являются митохондрии [5], митохондрии и хлоропласты — у растений [1].
Исходя из этого, можно предположить, что адаптогенные вещества должны влиять на генерацию АФК этими органеллами. На такую роль претендуют, в первую очередь, антиоксиданты, в частности синтетические фенольные антиокси-данты, имеющие довольно высокие коэффициенты взаимодействия с пероксильными радикалами (к7) [6, 7]. Выбор антиоксидантов именно
этого класса обусловлен, прежде всего, простотой их производства, высокой эффективностью обрыва цепей, возможностью изменения свойств в широких пределах за счет варьирования заместителей и малой токсичностью [8]. Кроме того, основанием для отбора данного класса антиокси-дантов в наших исследованиях послужил и тот факт, что природные антиоксиданты также относятся к классу замещенных фенолов и их производных [9].
Дыхательная цепь митохондрий растений и животных организована сходным образом, а основные различия касаются СМ-резистентного
переноса электронов и строения МЛЭИ-дегидро-геназного участка [10], поэтому основные механизмы функционирования адаптогенов изучали как на митохондриях печени крыс, так и на митохондриях, выделенных из запасающей паренхимы сахарной свеклы и этиолированных проростков гороха. В качестве адаптогенов были выбраны пространственно-затрудненные фенолы: фено-зан калия (калиевая соль 2,6-ди-трет-бутил-4-гидроксифенилпропионовой кислоты) и анфен (1-М-(ацетиламидо)-1-(3,5-ди-трет-бутил-4-гид-роксибензил)метилмалонат натрия) [11, 12]. Мы предположили, что они могут повышать устойчивость животных к стрессовым воздействиям.
ОН
(СНз)зСх Х/С(СНз)з
ОН
СН2СН2СООК
24-
(СНз)зС
С(СНз)з
СН
2
НзС-СО-КН-С-СОО№
Фенозан калия
Так как регуляторы роста и развития (РРР) повышают устойчивость растений к действию стрессовых факторов [13], то можно предположить, что они могут влиять на генерацию АФК митохондриями. У растительных организмов защита от окислительного стресса осуществляется не только антиоксидантной системой клетки. Снижение генерации АФК митохондриями достигается и благодаря активации альтернативного пути, ответвляющегося от основной дыхательной цепи на уровне убихинона и переносящего электроны непосредственно на кислород на уровне альтернативной оксидазы [14].
Предполагается, что вклад в защиту клетки от окислительного стресса вносит также и мито-хондриальный АТР-чувствительный калиевый (Рш11оКА1Р) канал. Функционирование Рш11оКЛТР тесно связано с К+/Н+-обменом. Это позволяет осуществлять "калиевый цикл", который обеспечивает возвращение Н+ в матрикс митохондрий, т.е. снижение мембранного потенциала. В клетках млекопитающих "калиевый цикл" эффективен лишь в митохондриях сердечной мышц. Этот цикл не вносит большого вклада в разобщение дыхания митохондрий в других тканях, так как его максимальная активность составляет 20% от общего пула протонов, генерируемых дыхательной цепью [15]. Таким образом, активаторы шИоКАТР могут использоваться лишь в качестве препаратов, защищающих сердечную мышцу в условиях стресса, например при гипоксии. В клетках растений активность этого цикла сопоставима с активностью протонных насосов дыха-
СООН Анфен
тельной цепи митохондрий [15], защита от окислительного стресса таким образом может осуществляться за счет активации РшИоКАТР.
Возможно, РРР повышают устойчивость растений к действию стрессовых факторов, проявляя либо антиоксидантные свойства, либо способность активировать альтернативную оксидазу или РшйоКАТР.
Протективные свойства РРР изучали, используя синтезированные в Институте органической и физической химии им. А.Е. Арбузова РАН Казанского Научного центра мелафен (меламиновую соль бис-(оксиметил)фосфиновой кислоты) и пирафен (соль бис-(оксиметил)фосфиновой кислоты 2,4,6-триаминопиримидина):
КН2
К^К О
^ 11 -НОР(СН2ОН)2 ^ КН2
Н2К
Мелафен
КН2
Н2К
N
Л
N КН2
НО
О
Д^СН2ОН СН2ОН •
Пирафен
Цель работы состояла в изучении биоэнергетических характеристик митохондрий в условиях стресса и влияния на данные характеристики изучаемых препаратов.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Работу проводили на митохондриях печени крыс линии Вистар, митохондриях этиолированных проростков гороха и митохондриях, выделенных из запасающей паренхимы сахарной свеклы.
Митохондрии печени крысы выделяли методом дифференциального центрифугирования [16]. Первое центрифугирование проводили при 600 g в течение 10 мин, второе — при 9000 g, 10 мин. Осадок ресуспендировали в среде выделения. Соотношение ткань : среда = 1 : 0.25. Среда выделения: 0.25 М сахароза, 10 мМ HEPES, pH 7.4.
Митохондрии из 5-дневных эпикотилей проростков гороха (Pisum sativum) или корнеплодов сахарной свеклы (Beta vulgaris L.) выделяли по методу [17] в нашей модификации. Эпикотили гороха длиной 3—6 см (20—25 г) или 25—30 г запасающей паренхимы сахарной свеклы гомогенизировали со 100 мл среды выделения, содержащей: 0.4 М сахарозу, 5 мМ ЕЭТА, 20 мМ КН2РО4 (рН 8.0), 10 мМ KCl, 2 мМ 1,4-дитиоэритрита (C4H10O2S2) и 0.1% БСА (свободный от жирных кислот). Гомогенат центрифугировали при 25000 g в течение 5 мин. Второе центрифугирование проводили в течение 3 мин при 3000 g. Митохондрии осаждали в течение 10 мин при 11000 g. Осадок ресуспендировали в 2—3 мл среды, содержащей 0.4 М сахарозу, 20 мМ КН2РО4 (рН 7.4), 0.1% БСА (свободный от жирных кислот), и вновь центрифугировали при 11000 g в течение 10 мин.
Скорость дыхания митохондрий из печени крыс, корнеплодов сахарной свеклы и проростков гороха регистрировали электродом типа Кларка, используя полярограф LP-7 (Чехия). Среда инкубации митохондрий печени содержала 0.25 М сахарозу, 10 мМ трис-НС1, 2 мМ MgSO4, 2 мМ KH2PO4, 10 мМ KCl (рН 7.5) (28°С). Среда инкубации митохондрий сахарной свеклы и митохондрий из проростков гороха содержала 0.4 М сахарозу, 20 мМ HEPES-трис-буфер (рН 7.2), 5 мМ КН2РО4, 4 мМ MgC12, 0.1% БСА (28°С).
Белок определяли биуретовым методом.
Уровень перекисного окисления липидов (ПОЛ) оценивали флуоресцентным методом [18]. Липи-ды экстрагировали из митохондрий, содержащих 3—5 мг белка, смесью хлороформ : метанол 2 : 1 (по объему). Соотношение митохондрии : смесь хлороформ—метанол = 1 : 10. Митохондрии гомогенизировали в течение 1 мин при температуре 10°С, затем к смеси добавляли равный объем дистиллированной воды, быстро смешивали и переносили в 12 мл центрифужные стаканы. (Промывание водой необходимо для удаления флавиновых компонентов, имеющих максимум флуоресценции в области 520 нм). Центрифугировали в течение 5 мин при 600 g. Отбирали 3 мл нижнего (хлороформного) слоя и добавляли 0.3 мл метанола. Флуоресценцию регистрировали в десятимилли-
метровых кварцевых кюветах на спектрофлуори-метре FluoroMax-
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.