ФИЗИОЛОГИЯ РАСТЕНИЙ, 2015, том 62, № 3, с. 420-431
= ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
УДК 581.1
РОЛЬ АКРОПЕТАЛЬНОГО ВОДНОГО ТРАНСПОРТА В РЕГУЛЯЦИИ УРОВНЯ ЦИТОКИНИНОВ В СТЕБЛЯХ ПРОРОСТКОВ ГОРОХА
© 2015 г. А. А. Котов, Л. М. Котова
Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН, Москва Поступила в редакцию 23.06.2014 г.
Удаление главного побега растения (декапитация) вызывает в его стебле значительный подъем уровня цитокининов (CKs), синтез которых, как полагают, индуцируется снижением содержания ИУК, однако в ряде случаев показано, что снижение концентрации ауксина в стебле не всегда приводит к ожидаемому увеличению содержания CKs. Декапитация также нарушает акропетальный водный транспорт по ксилеме (XT), роль которого в контроле уровня CKs не изучена. Для выяснения этого вопроса 11-дневные проростки гороха (Pisum sativum L., сорт Адагумский) декапитирова-ли по первому междоузлию, и у части растений место удаления побега вакуумизировали при давлении — 0.055 МПа, обеспечивая поддержание XT со средней скоростью 0.16 мкл/с. В анализируемых тканях верхней части гипокотиля и базальной части эпикотиля преимущественными формами как цитокининов зеатинового типа (Z-CKs), так и изопентениладенинового типа (iP-CKs) являлись ри-ботиды, рибозиды и их глюкозиды. Основным CK ксилемного сока был зеатинрибозид (ZR), уровень которого оставался неизменным на протяжении 6-часовой вакуумной стимуляции XT. После декапитации проростков через 3 ч происходило увеличение содержания iP-CKs (в 2 раза в гипоко-тиле и в 7 раз в эпикотиле), тогда как уровень Z-CKs возрастал только через 6 ч (в 4—6 раз). Через 18 ч декапитация вызывала подъем содержания ZR в 35 раз, iPR в 7 раз в гипокотиле и в 40 раз в эпикотиле. Поддержание XT после декапитации в течение 6 ч в 2 раза снижало аккумуляцию iP-CKs в тканях гипокотиля и эпикотиля, делая их уровень равным как после 3 ч декапитации без XT, и полностью подавляло изменение содержания Z-CKs. Возможность снижения накопления CKs за счет их вымывания из тканей с током ксилемного сока маловероятна, поскольку риботид/рибозидное соотношение в тканях с XT не было изменено в сторону увеличения доли нетранспортируемых рибо-тидов. Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о том, что наряду с ИУК XT также может являться фактором контроля содержания CKs в стебле, выяснение механизма действия которого требует дальнейших исследований.
Ключевые слова: Pisum sativum — ELISA — зеатинрибозид — изопентениладенозин — цитокинины
DOI: 10.7868/S0015330315020098
ВВЕДЕНИЕ
Цитокинины (СКз) являются одними из ключевых регуляторов роста и развития растений [1, 2], и
Сокращения: AcOH — уксусная кислота; BHT — бутилирован-ный гидрокситолуол (от butylated hydroxytoluene), антиокси-дант; CK(s) — цитокинин(ы); EtOH — этанол; G-Z, G-ZR, G-iP и G-iPR — глюкозиды tZ, ZR, iP и iPR соответственно; i.d. — внутренний диаметр; iP — изопентениладенин; iPR — изпентениладенозин; iP-CKs — цитокинины изопентениладенинового типа; iPN — нуклеотид изопентениладенина; K-Pi — фосфат калия; MeOH — метанол; OD — оптическая плотность; PBS - 0.01 М Na-фосфатный буфер с 0.15 М NaCl, рН 7.4-7.5; PBS-Т - PBS с 0.05% Triton X-100; PVPP - нерастворимый поливинилполипирролидон; RT - комнатная температура (от room temperature); tZ - транс-зеатин; XT -ксилемный транспорт; Z-CKs - цитокинины зеатинового типа; ZN - нуклеотид зеатина; ZR - зеатинрибозид. Адрес для корреспонденции: Котов Андрей Александрович. 127276 Москва, Ботаническая ул., 35. Институт физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН. Электронная почта: kotov_andrei-62@mail.ru
знание механизмов контроля их содержания важно для понимания таких процессов как, например коррелятивный рост и апикальное доминирование. Вап§ег& впервые показал, что удаление главного побега (декапитация) вызывает мощное и быстрое увеличение уровня СКз как в ксилем-ном соке [3], так и в тканях оставшейся части стебля [4]. В обоих случаях нанесение НУК на место декапитации значительно тормозило увеличение содержания СКз. В роли органа, ответственного за синтез СКз и определяющего СКз-статус всего растения, обычно рассматривали корень [5, 6], передающий СКз с ксилемным током в побег и играющий важную роль, например в нитратном сигналинге [7, 8]. В отношении декапитационного сигнала корень, в отличие от стебля, практически не задействован в ответе, что продемонстрировали исследования, проведенные на проростках гороха. Декапитация пророст-
ков увеличивала содержание CKs в 4—6 раз в междоузлиях с максимальным значением в первый день, в корнях же наблюдалось повышение только в 1.5—2 раза, которое происходило на 2— 3-й день [9].
Японским исследователям удалось выявить два гена, кодирующих ключевой фермент биосинтеза CKs, аденозинфосфат-изопентенил-трансферазу (adenosine phosphate—isopentenyl-transferase), PsIPT1 и PsIPT2, экспрессия которых в междоузлиях гороха активировалась декапита-цией и тормозилась экзогенным ауксином [10]. Важно то, что активация этих генов коррелировала с увеличением CKs как в междоузлиях, так и в пазушных почках, однако в последних декапита-ция не влияла на экспрессию PsIPTl и PsIPT2. В корнях декапитация практически не изменяла уровень экспрессии PsIPTl и PsIPT2, и был сделан вывод о том, что основным местом CKs-отве-та является ткань стебля, и активация синтеза CKs в ней происходит за счет снижения уровня ауксина.
Несмотря на наличие доказательств, сводящих эффект декапитации к прерыванию транспорта ИУК из верхушки побега, данные других работ свидетельствуют о способности побега контролировать уровень CKs, используя сигнал неауксиновой природы. Нанесение на место де-капитации ланолиновой пасты с 150 мМ НУК значительно ослабляло в узлах и междоузлиях эпикотиля проростков гороха накопление CKs зеатинового (Z-CKs) и изопентениладенинового типа (iP-CKs), однако не подавляло полностью, несмотря на значительную концентрацию примененного ауксина [4]. В опытах на частично дефо-лиированных проростках гороха показано, что одинаковый транспорт ИУК и ее содержание в стебле, индуцируемый молодыми или более взрослыми и транспирационно активными листьями, для последних сопровождался более низким уровнем CKs в междоузлиях [11]. В других экспериментах на растениях гороха "отжиг" горячим парафином небольшого участка стебля, который убивал живые клетки, делая невозможным базипетальный транспорт ауксина, снижал под местом обработки экспрессию таких ауксин-индуцируемых генов как IAA4/5, RMS1 и RMS5, но не влиял на экспрессию PsIPT1 и PsIPT2 [12]. Ксилемное сообщение с верхней частью побега при "отжиге" не было нарушено. Когда вместо "отжига" использовали декапитацию, нарушающую как акропетальный водный транспорт, так и базипетальный транспорт ауксина, картина экспрессии IAA4/5, RMS1 и RMS5 сохранялась аналогичной, а экспрессия PsIPT1 и PsIPT2 активировалась. Следует также отметить, что при "отжиге" базальные пазушные почки оставались покоящимися, а после декапитации их рост активировался [12].
Таким образом, предположение, что наряду с ауксином фактор "ксилемного потока", поддерживаемый растущими и транспирирующими листьями, наиболее вероятен в контроле синтеза CKs в стебле, представляется вполне оправданным. Задача настоящей работы состояла в изучении влияния акропетального ксилемного транспорта (xylem transport, XT) на уровень CKs в стеблевых тканях, для чего на 11-дневных проростках гороха был проведен эксперимент с его искусственным поддержанием методом вакуумизации. Сравнение уровня CKs в гипокотиле и основании эпикотиля между декапитированными растениями, и растениями, в которых проводили вакууми-зацию места удаления побега, показало, что поддержание XT может либо значительно снизить начавшееся после декапитации накопление CKs, либо задержать его начало на 3 ч.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Выращивание растительного материала и взятие проб для анализа цитокининов. Семена гороха (Pisum sativum L.) сорта Адагумский стерилизовали погружением на 1 мин в свежеприготовленную смесь 3% H2O2 c 96% этанолом (EtOH) (1 : 1), просушивали на фильтровальной бумаге в токе воздуха в течение 20 мин и инкубировали в темноте при 25°С в накрытой стеклом эмалированной кювете на стеклянной подложке между двумя слоями влажной фильтровальной бумаги 1 сутки и еще 2 суток после долива дистиллированной воды до погружения семян на одну треть. На 4-й день проросшие семена высаживали в 0.5-литровые сосуды с водопроводной водой по 40 шт. и переносили в климатическую камеру с температурой 20 ± 1°С, уровнем света 10 клк и режимом 14 ч свет/10 ч темнота (минифитотрон на основе холодильной камеры Grönland ("Kühlmöbelwerk Erfurt", Германия), модифицированной добавлением панели из 8 люминесцентных ламп (L 18W/640, cool white, "Os-ram", Россия).
На 8-й день проростки по 9 шт. переносили в прямоугольные сосуды (6 х 16 х 6 см, 400 мл) с водопроводной водой. Часть 11-дневных проростков декапитировали по первому междоузлию, и у интактных растений, а также у 3-, 6- и 18-часовых декапитированных проростков отсекали 2-миллиметровые сегменты эпикотиля и гипокотиля, отступив приблизительно на 2—3 мм над или под семядольным узлом. Пробы по 10 сегментов запаковывали в алюминиевую фольгу, взвешивали и помещали в жидкий азот, в котором хранили до анализа. Для каждого опытного варианта было взято по 4 пробы.
Измерение ксилемного транспорта в 11-дневных интактных проростках. Для измерения транспи-рационного потока воды 6-дневные проростки переносили по 8 шт. в 3 сосуда на 150 мл с крыш-
кой, снабженной небольшими отверстиями для корней, и до 11-го дня воду в сосудах ежедневно обновляли. На 11-й день и спустя еще сутки сосуды с растениями взвешивали, определяя суточную потерю воды за счет транспирации.
Проведение вакуумной индукции XT в декапити-рованных проростках. Устройство вакуумирую-щей установки схематично показано на рис. 1. Прямоугольные сосуды с 11-дневными проростками размещали в каркасе с закрепленным 9-ка-нальным воздуховодом, каждый канал которого представлял силиконовую трубку с внутренни
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.