МИКРОБИОЛОГИЯ, 2012, том 81, № 2, с. 185-195
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
УДК 579.22:577.344
РОЛЬ АЛКИЛОКСИБЕНЗОЛОВ В ОТВЕТЕ ESCHERICHIA COLI НА ЛЕТАЛЬНОЕ ВОЗДЕЙСТВИЕ УЛЬТРАФИОЛЕТОВОГО ОБЛУЧЕНИЯ © 2012 г. Д. Г. Дерябин*, 1, О. К. Давыдова*, И. В. Грязева*, Г. И. Эль-Регистан**
* Оренбургский государственный университет ** Учреждение Российской академии наук Институт микробиологии РАН им. С.Н. Виноградского, Москва
Поступила в редакцию 30.11.2010 г.
Исследовано влияние алкилоксибензолов (АОБ) — химических аналогов ауторегуляторных ^-факторов микроорганизмов — на формирование стрессового ответа бактериальных клеток при воздействии УФ-облучения: индукцию SOS-системы, сохранение жизнеспособности клеток и диссоциативные S —- R переходы тестерного штамма Escherichia coli с клонированными под контролем промотора гена recA генами биолюминесценции. Установлена однотипность реакции бактерий на действие природного стрессора (УФ-облучения) и повышение концентрации АОБ, что свидетельствует о функционировании последних как алармонов — сигналов тревоги. Показано, что предынкубация бактерий с алкилоксибензолами существенно повышает их выживаемость при УФ-облучении в летальных дозах при относительном снижении активности SOS-ответа и одновременном увеличении частоты диссоциативных переходов. Эффективность защитного действия алкилоксибензолов возрастает с увеличением степени гидрофобности АОБ. Обсуждается вероятный механизм протекторного действия АОБ, основанный на способности к взаимодействию с биополимерами, что обусловливает изменение их структурной организации с формированием устойчивости к широкому спектру стрессовых факторов. В частности, такой "пассивный" механизм защиты уменьшает повреждаемость ДНК при УФ-облучении, что результирует в снижении показателей индукции SOS-системы, реализующей "активный" механизм защиты бактериальных клеток. В результате сохранение жизнеспособности в условиях летального воздействия УФ-облучения оказывается возможным при минимальных значениях активности репарационных процессов при одновременном увеличении фенотипической вариабельности выжившей части бактериальной популяции.
Ключевые слова: Escherichia coli, ультрафиолетовое облучение, гомологи алкилоксибензолов, SOS-система, ген recA, биолюминесценция, диссоциативные S —»- R переходы, выживаемость клеток, пассивная и активная защита ДНК.
Важным достижением последних десятилетий явилось понимание молекулярных механизмов биологической активности внеклеточных ауторегуляторных факторов, контролирующих многие аспекты функциональной активности и клеточной дифференцировки прокариот [1]. В полной мере сказанное относится к видонеспецифичным внеклеточным ауторегуляторам (а^-факторам), представленным у ряда бактерий и дрожжей алкилоксибензолами (АОБ), и контролирующим переход воспринимающих их клеток в гипомета-болическое и анабиотическое состояние [2]. Другой стороной биологической активности АОБ является их функционирование как адаптогенов, участвующих в развитии устойчивости микроорганизмов к широкому спектру повреждающих факторов [3]. В частности, в ряде исследований показаны протекторные эффекты АОБ в отношении клеток культур бактерий и дрожжей при различных стрессовых воздействиях [4, 5], в том чис-
1 Автор для корреспонденции (e-mail: dgderyabin@yandex.ru).
ле УФ-облучении [6], что явилось основанием для углубленного исследования механизмов действия названной группы микробных ауторегуля-торов.
При проведении работ в данном направлении было установлено, что молекулярные механизмы регуляторных эффектов АОБ основаны на их способности к неспецифическому связыванию с различными клеточными биополимерами (белками, ДНК) и мембранными липидами за счет образования водородных связей, гидрофобных и электростатических взаимодействий [7—10]. Так, ком-плексообразование АОБ с ферментными белками обусловливает изменение их конформации, и, вследствие этого, функциональной активности и стабильности [7, 10, 11]. С другой стороны, в наших предыдущих работах показано непосредственное взаимодействие АОБ с ДНК, сопровождающееся изменениями ее топологии и физико-химических характеристик [8]. При этом важным эффектом явилось повышение устойчивости об-
разующихся комплексов ДНК + АОБ к ультрафиолетовому облучению [9].
Отметим, что в обычных условиях ДНК интенсивно поглощает УФ в диапазоне 240—300 нм с максимумом 254 нм, что является причиной глубоких повреждений этого биополимера, в своих крайних проявлениях ведущих к образованию одно - и двунитевых разрывов ДНК. В этой связи важная роль в защите клеток от УФ-излучения отводится системе репарации ДНК, в которой наибольшее значение имеет функционирование генов SOS-ответа [12]. Механизм индукции SOS-регулона основан на взаимодействии продуктов генов recA и lexA, из которых белок RecA, связываясь с поврежденными одноцепочечными участками ДНК, способствует расщеплению димеров белка LexA, тем самым снимая обусловливаемую последним репрессию около 40 RecA-зависимых генов, задействованных в процессах репарации ДНК, в том числе и самого гена recA [13].
Первые исследования эффектов алкилокси-бензолов на активность репарационных процессов свидетельствовали о возможности позитивной и негативной регуляции стрессовых генов SOS-системы бактерий как результата воздействия различающихся гидрофобностью гомологов АОБ [6]. Однако, следует учитывать, что защитные системы клетки включают также механизмы "пассивной" защиты, в которой АОБ могут быть задействованы, во-первых, как ловушки активных форм кислорода [10] и, во-вторых, как стабилизаторы молекул биополимеров [7-11].
Сказанное определило интерес к целостной картине взаимоотношений "пассивных" и "активных" механизмов защиты ДНК от УФ-излуче-ния, в развитие которых вовлечены алкилоксибен-золы. При этом дополнительная интрига проведения работ в данном направлении заключалась в воспроизведении существующих в природных экосистемах постоянных воздействий летальной интенсивности, отличающихся от ранее использованных моделей сублетальных краткосрочных стрессов, в том числе возникающих при УФ-об-лучении [4-6].
В этой связи целью настоящей работы стало изучение роли алкилоксибензолов как природных адаптогенов в стрессовом ответе Escherichia coli на ультрафиолетовое облучение летальной интенсивности с акцентом на выявление эффектов различающихся гидрофобностью гомологов АОБ в отношении "активных" и "пассивных" механизмов защиты ДНК при подобном воздействии.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
В качестве химических аналогов ауторегуля-торных ä^-факторов микробного происхождения был использован ряд различающихся длиной и расположением гидрофобного алкильного радикала гомологов алкилоксибензолов, включающий коммерчески доступные препараты С7-АОБ, С11-АОБ и С12-АОБ ("Sigma", США), а также специально синтезированные С9-АОБ и С18-АОБ ("Enamine", Украина) со степенью очистки 99.9% (табл. 1).
В качестве модельного микроорганизма использован рекомбинантный штамм Escherichia coli recA'::lux, любезно предоставленный И.В. Мануховым (ГосНИИгенетика, Россия). Его особенностью является наличие плазмиды precA '::luxCDABE-AmpR с кассетой lux-генов почвенной люминесцирующей бактерии Photorhab-dus luminescence Zm 1, клонированных под промотором гена recA E. coli, а также селектирующего гена устойчивости к антибиотику ампициллину. Данная генетическая конструкция сообщает несущим ее клеткам достаточно низкий фоновый уровень свечения, многократно усиливающийся при повреждении ДНК в результате синхронной индукции как самого гена recA, так и находящихся под контролем его промотора генов биолюминесценции. Соответственно, измерение интенсивности свечения тестерного штамма позволяет в режиме реального времени и без проведения каких-либо дополнительных процедур количественно оценивать уровень активации SOS-системы, в том числе развивающейся при УФ-облу-чении [14].
Перед проведением исследования штамм E. coli recA' '::lux выращивали в течение 16—18 ч при 37°C в LB-бульоне ("Sigma", США) в присутствии 20 мкг/мл ампициллина. Непосредственно перед постановкой эксперимента культуру разводили 1 : 20 свежей питательной средой того же состава и инкубировали 3—5 ч до достижения оптической плотности 0.2 ед. (к = 640 нм, l = 1 см, "Флюорат-02 Панорама", НПФ Люмекс, Россия), что соответствовало ранней фазе экспоненциального роста периодической культуры. В опытных вариантах аликвоты этой культуры смешивали с растворами АОБ (1 : 1) так, чтобы их конечные концентрации составляли 10-5, 10-4 и 10~3 М. В контрольных вариантах растворы АОБ заменяли дистиллированной водой. Смеси предынкубировали в течение 60 мин, после чего пробы по 1 мл разливали в лунки полистироловых планшетов.
УФ-облучение исследуемых проб осуществляли с использованием широкополосной ртутно-кварцевой лампы ("Osram", Германия) с расстояния 10 см через интерференционный светофильтр с максимумом пропускания в области
Таблица 1. Использованные химические гомологи алкилоксибензолов
Обозначение
Структурная формула
Молекулярный вес
Производитель
С7-АОБ
С9-АОБ
С11-АОБ
С12-АОБ
С18-АОБ
HO,
HO
0-
CH3
HO
HO
HO,
(CH2)2-CH3
«JMCH2)4-CH3 HO
HO _
Q
HO
>
(CH2)irCH3
124
'Sigma", США
152
'Enamine", Украина
180
Sigma", США
194
Sigma", США
278
'Enamine", Украина
254 нм, обеспечивающей преимущественное повреждение ДНК бактериальных клеток при минимальном воздействии на другие субклеточные структуры. Энергетическая освещенность образцов, измеренная с использованием УФ-радиомет-ра "ТКА-ПКМ" (Россия), составила 6.7 Вт/м2, время экспозиции варьировало от 0 до 180 мин с дискретностью 60 мин, что соответствовало суммарным дозам УФ-облучения 1.21, 2.43 и 3.64 Дж/м2.
Через указанные временные промежутки (60, 120, 180 мин) отбирали часть анализируемых проб в объеме 100 мкл, в которых оценивали интенсивность биолюминесценции с использованием микропланшетного биолюминометра ЬМ 01Т ("1т-тип^ееИ", Чехия).
Параллельно в исследуемых пробах проводили количественный учет жизнеспособных клеток по численности колониеобразующих единиц (КОЕ), высевая аликвоты по 10 мкл на ЬВ-ага
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.