РОССИЙСКИЙ ИММУНОЛОГИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ, 2015, том 9(18), № 2, с. 209-215
ОРИГИНАЛЬНАЯ СТАТЬЯ
РОЛЬ АЛЛЕЛЬНОГО ПОЛИМОРФИЗМА ГЕНОВ ^-6 И ПЛ8 В РАЗВИТИИ ПЕРИНАТАЛЬНЫХ ИНФЕКЦИЙ У НОВОРОЖДЕННЫХ
© 2015 г. Н.Д. Рагимова
Научно-исследовательский институт педиатрии им. К.Я. Фараджевой,
Баку, Азербайджан
Поступила: 24.04.2015. Принята: 25.05.2015
Целью настоящего исследования явилось изучение ассоциированности полиморфизма промоторных регионов генов интерлейкина-6 (Ш-6) и интерлейкина-18 (Ш-18) у новорожденных с перинатальными инфекциями, а также установление связи аллельных вариантов генов Ш-6 и ^-18 с уровнем их продукции. Полиморфизм генов промоторных регионов 1Ь-6 в позициях —174, —572, —597 и Ш-18 в позициях —656, —137, + 105 определялся у 76 здоровых новорожденных и 50 новорожденных с перинатальными инфекциями. Статистически значимые различия по аллельным вариантам между здоровыми и инфицированными новорожденными свидетельствуют о роли однонуклеотидных полиморфизмов (ОНП) в риске развития инфекции. Установлено увеличение частоты встречаемости G аллеля в промоторной области гена 1Ь-6 в позициях —174, —572 и Ш-18 в позиции —656, а также нуклеотидные замены, в других позициях генов 1Ь-6 и Ш-18, что указывает на значимость точковых мутаций в развитии внутриутробных инфекций. Установленные в про-моторных регионах однонуклеотидные полиморфизмы, по всей вероятности, происходят в несиномомичных кодирующих сайтах, что объясняет их влияние на экспрессию генов и эффективность транскрипции, а также ассоциируется с изменением уровня цитокинов у новорожденных. Установленный полиморфизм генов Ш-6 и Ш-18 и ассоциация с встречаемостью перинатальных инфекций у новорожденных позволяют использовать их в качестве предиктора врожденной инфекции.
Ключевые слова: полиморфизм гена 1Ь-6, полиморфизм гена Ш-18, перинатальные инфекции, новорожденные
ВВЕДЕНИЕ
Врожденная инфекционная патология у новорожденных является одной из наиболее сложных и важных медико-социальных проблем современной педиатрии и нео-натологии. Так, по данным ряда авторов, внутриутробные инфекции (ВУИ) развиваются у 27,4 — 36,6% живорожденных детей, а в структуре смертности новорожденных инфекционная патология занимает перво-
Адрес: AZ1065 Азербайджан, г. Баку, Научно-исследовательский институт педиатрии им. К.Я. Фараджевой, ул. Басти Багирова 17; Наиля Джалил кызы Рагимова. E-mail: rahimova_nailya@mail.ru
Автор:
Рагимова Н.Д. — к.м.н., доцент, зам. директора по науке НИИ педиатрии, г. Баку, Азербайджан
степенное место, обусловливая от 11 до 45% потерь [1—3].
Наличие инфекции способствует развитию воспалительной реакции как в организме матери, так и у плода и реализуется посредством выработки провоспалительных цитокинов. Выработка цитокинов в ответ на различные экзогенные агенты является генетически детерминированной. Согласно последним данным, различия в генах, контролирующих защитные реакции организма, могут влиять на уровень продукции цитокинов и тем самым на характер развития и протекания иммунного ответа [4, 5].
Наиболее частой причиной изменений в структуре генов являются замены и деле-ции отдельных нуклеотидов или фрагментов определенного участка ДНК. В геноме человека имеется гигантское количество вариа-
ций, большинство из которых представляют собой однонуклеотидные полиморфизмы (ОНП), обозначаемые в зарубежной литературе SNP — single nucleotide polymorphism («снипы»). Множество ОНП находится в некодирующих районах ДНК т.е. являются синонимичными изменениями. Источником изменений, непосредственно влияющих на вероятность развития различных болезней, являются именно мутации, происходящие в несинонимичных участках ДНК. Нуклео-тидные полиморфизмы (SNP) известны для многих генов цитокинов. Нуклеотидные полиморфизмы, локализирующиеся в регуля-торных участках генов, могут оказывать влияние на транскрипционную активность генов, тем самым увеличивая или уменьшая уровень соответствующего цитокина в крови [6 — 9].
Целью настоящего исследования является изучение ассоциированности полиморфизма промоторных регионов генов IL-6 и IL-18 у новорожденных с перинатальными инфекциями, а также установление связи аллель-ных вариантов генов IL-6 и IL-18 с уровнем их продукции.
МАТЕРИАЛЫ МЕТОДЫ
С целью определения функционального полиморфизма генов IL-6, IL-18 проводилось наблюдение над 50 новорожденными с верифицированной иммуноферментным анализом и полимеразно-цепной реакцией внутриутробной инфекцией. Среди инфицированных новорожденных диагностирована цитомегаловирусная инфекция (ЦМВИ) у 27, микст-инфекция (ЦМВИ + ГВИ, ЦМВИ + Ток-соплазмоз) у 7 и бактериальная инфекция у 16 новорожденных. Из них у 7 новорожденных был диагностирован сепсис, у 9 —локальный воспалительный процесс инфекционного генеза (пневмония, пиодермия, омфалит, остеомиелит, конъюнктивит, отит). Из 50 детей 31 родились доношенными и 19 недоношенными. Средний гестационный возраст доношенных детей на момент рождения составил 38,5 ± 0,2 недель, недоношенных детей с низкой массой тела (НМТ) 33,6 ± 0,3 недель, с очень низкой массой тела (ОНМТ) 29,6 ± 0,4 недель, с экстремальной низкой массой тела (ЭНМТ) 26,3 ± 0,5 недель. При этом колебания среднего значения массы тела у доношенных новорожденных находились в пределах 3000 ± 117 г, у недоношенных детей с НМТ 1892 ± 42 г, с ОНМТ 1226 ± 29 г,
с ЭНМТ 900 ± 62 г. Контрольную группу составили 76 новорожденных без признаков инфекции.
Для определения содержания в сыворотке крови IgM и IgG к возбудителям инфекций TORCH группы проведен ИФА стандартным методом с помощью набора реактивов «Human» (Германия) на анализаторе «Sirio» (Италия). Для уточнения этиологии врожденной инфекции исследованы биологические среды ребёнка (кровь, слюна, моча) методом полимеразной цепной реакции (ПЦР). Определение IL-6, IL-18 выполняли стандартным методом твердофазового («сэнд-вич»-вариант) иммуноферментного анализа (ИФА) с использованием диагностических тест-систем производства «Вектор-Бест» (Новосибирск). Образцы сыворотки крови (0,5—1,0 мл) исследуемых новорожденных, взятые на 3 — 5 сутки жизни хранили до определения цитокинов при —20° С. Уровень IL-6 определялся с помощью набора реактивов «Интерлейкин-6-ИФА-Бест» в диапазоне от 0 до 300 пг/мл. Уровень IL-18 определялся с помощью набора реактивов «Интерлей-кин-18-ИФА-Бест», предназначенного для количественного определения IL-18 в исследуемых образцах методом твердофазного им-муноферментного анализа в диапазоне от 0 до 1000 пг/мл.
Полиморфизм генов промоторных регионов IL-6 в позициях —174, —572, —597 и IL-18 в позициях —656, — 137, +105 определялся у 76 здоровых новорожденных и 50 новорожденных с перинатальными инфекциями. Сравнительный анализ полиморфизма генов интерлейкинов проводился по следующей методике. Образцы сыворотки крови (5 мл) смешивались с 0,5 ЭДТА и хранились при —20° С. Экстракция ДНК проводилась по методу «Saltinout», чистота препаратов проверялась на спектрофотометре по соотношению длины волн 260/280. Во всех экстрагированных образцах показатели ДНК колебались в интервале 1,7—1,9. С целью определения полиморфизма генов использовались методы PCR-RFLP (Polimeraza change reaction — Полимеразная цепная реакция — Restriction Fragment Length Polymorphysm— Полиморфизм длины рестрикционных фрагментов), CAPS (Cleaved amplified polymorphic sequence — Расщепленная амплифицирован-ная полиморфная последовательность). При амплификации генов различных цитокинов использовались олигонуклеотидные прай-
меры, комплементарные фланкирующим областям амплифицируемого ДНК фрагмента. В начале при температуре 96° С осуществлялась денатурация ДНК (расщепление двойной спирали ДНК на две одноцепочные молекулы). ПЦР проводилась в 3 этапа: 30 сек при 96° С, 30 сек при 58,4° С и 45 сек при 72° С, далее в течение 5 мин при 72° С инкубация завершалась. После ПЦР амплифицированные фрагменты ДНК при помощи рестриктазы расщеплялись на фрагменты. Фрагменты RFLP наносились на 2%-ные агарозные гели с 1 TAE буфером (40 mM Трис-ацетат vs 1 mM EDTA pH = 8,0) и проводился электрофорез. В последующем гелевые пластинки окрашивались 0,05%-раствором бромистого этидия. Для определения фрагментов ДНК гели фотографировались Gel Doc 1000 камерой. Частота соответствующих аллелей и генотипов у наблюдаемых здоровых и инфицированных детей рассчитывалась по агарозным гелям. Достоверность полученных данных определялась при помощи х2 теста с использованием SPSS компьютерной программы.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Ведущими в клинической картине заболевания у наблюдаемых новорожденных выступали интоксикационный, желтушный синдром, неврологические расстройства, синдром дыхательных расстройств. Разнообразие проявлений перинатальных инфекций было обусловлено рядом гомеостатических особенностей организма, а также врожденным иммунодефицитом. IL-6 — это мульти-функциональный цитокин, который играет существенную роль как во врожденном, так и приобретенном иммунитете. IL-6 также является одним из белков межклеточного взаимодействия, секретируемых при воспалительном процессе, оказывает существенное влияние на многие органы и системы, а также на обмен веществ. Согласно последним исследованиям, IL-6, являясь выраженным воспалительным компонентом, рассматривается как провоспалительный, так и противоспали-тельный цитокин. Доказано, что IL-6 способствует синтезу некоторых цитокинов, в то же время оказывает ингибирующее действие на образование Т-лимфоцитов и повышает клеточный иммунитет.
Исследователями был найден ряд ассоциаций полиморфизма IL-6 с различными заболеваниями инфекционного генеза [10].
Результаты изучения полиморфизма генов IL-6 в позициях —174 G/C, —572 G/C и —572 G/A представлены в табл. 1. Нами выявлено достоверно значимое различие ал-лельных вариантов G и C между здоровыми и инфицированными новорожденными в позиции —174. Так, у новорожденных с перинатальной инфекцией установлен более высокий уровень аллеля G (у больных 65%, здоровых 43,4%). Частота аллеля С у здоровых новорожденных равнялась 56,6%, встречаемость СС генотипа составляла 47,4%, в то время как у инфицированных новорожден
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.