МИКРОБИОЛОГИЯ, 2004, том 73, № 4, с. 479-485
= ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ =
УДК 579.841.12.013:577.152.3
РОЛЬ АНИОННЫХ ПОЛИМЕРОВ КЛЕТОЧНЫХ СТЕНОК ГРАМПОЛОЖИТЕЛЬНЫХ БАКТЕРИЙ-МИШЕНЕЙ В МЕХАНИЗМЕ ДЕЙСТВИЯ НА НИХ ВНЕКЛЕТОЧНЫХ БАКТЕРИОЛИТИЧЕСКИХ
ФЕРМЕНТОВ ЬУЗОБЛСТЕЯ 8Р.
© 2004 г. О. А. Степная*, Е. А. Бегунова*, И. М. Цфасман*, Е. М. Тульская**, Г. М. Стрешинская**, И. Б. Наумова **, И. С. Кулаев***
*Институт биохимии и физиологии микроорганизмов РАН им. Г.К. Скрябина, Пущино **Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова Поступила в редакцию 14.07.03 г.
Изучено действие внеклеточных бактериолитических ферментов Lysobacter зр. на грамположи-тельные бактерии. Показано, что для эффективного гидролиза пептидогликана грамположитель-ных бактерий необходимо электростатическое взаимодействие бактериолитических ферментов с анионным полимером клеточной стенки, в частности с тейхоевыми или тейхуроновыми кислотами. Механизм действия литических ферментов, вероятно, определяется не столько химической структурой тейхоевых и тейхуроновых кислот, сколько их отрицательным зарядом.
Ключевые слова: лизоамидаза, бактериологические ферменты, клеточная стенка, пептидогликан, анионные полимеры.
Бактериолитическими ферментами или пеп-тидогликангидролазами называют группу ферментов, гидролизующих химические связи пептидогликана - основного структурного компонента клеточных стенок бактерий. Внутриклеточные пептидогликангидролазы бактерий (автолизины) участвуют в процессах гидролиза и синтеза клеточных стенок, прорастания спор, роста и деления клеток. Внеклеточные бактериолитические ферменты необходимы бактериям для завоевания экологической ниши и в качестве "инструмента" для обеспечения их клеток пищей и энергией [1, 2].
Из культуральной жидкости бактерии Lyso-Ьа^ег ер. [3] был получен препарат лизоамидаза, который представляет собой комплекс, включающий три бактериолитических фермента - мура-мидазу и две бактериолитические пептидазы - Л1 и Л2 [4-6], а также высокомолекулярный отрицательно заряженный полисахарид. Положительно заряженные ферменты лизоамидазы взаимодействуют с отрицательно заряженным полисахаридом. Результатом этого взаимодействия является стабилизация внеклеточных бактериолитических ферментов Lysobacter ер. [7]. Лизоамидаза эффективно лизирует различные грамположительные бактерии, а также способна разрушать нативные клетки некоторых представителей грамотрица-тельных бактерий [8].
Основную структуру клеточных стенок грам-положительных бактерий составляет многослой-
ный пептидогликан, с которым ковалентно связаны анионные полимеры - тейхоевые или тейху-роновые кислоты [1, 9].
Пептидогликан является сложным полимером, состоящим из гликановых цепей, образованных чередованием К-ацетилмурамовой кислоты и К-ацетилглюкозамина. Через лактильный остаток мурамовой кислоты к гликановым цепям присоединены пептидные субъединицы, которые связаны друг с другом пептидными мостиками. Тейхоевые кислоты - полимер, включающий фо-сфодиэфирные, полиольные и сахарные остатки. Тейхуроновые кислоты образованы остатками уроновых кислот и сахаров. Тейхоевые или тейхуроновые кислоты связаны с пептидогликаном через шестой углеродный атом мурамовой кислоты.
Многокомпонентность, химическая неоднородность и архитектурная сложность субстрата бактериолитических ферментов по всей видимости определяет механизм их взаимодействия с клеточной стенкой бактерий, который в конечном счете может привести к гидролизу химических связей пептидогликана. При этом, на наш взгляд, большое значение имеет начальное место этого взаимодействия - внутреняя поверхность либо толща клеточной стенки в случае автолизинов или внешняя поверхность клеточной стенки в случае внеклеточных бактериолитических ферментов.
В ряде опубликованных работ затронут механизм действия автолитических ферментов ряда грамположительных бактерий. Так, например, показано, что эффективное действие автолизи-нов бацилл и стафилококков должно предваряться их электростатическим взаимодействием с тей-хоевыми кислотами [10]. Для эффективного автолиза клеток пневмококков и клостридий необходимо присутствие фосфорилхолиновых остатков на тейхоевой кислоте [11, 12]. Замена холина на этаноламин в структуре тейхоевой кислоты приводит к тому, что клетка не автолизиру-ется, не подвергается генетической трансформации, не лизируется в присутствии бактерицидных антибиотиков, и при этом подавляется отделение дочерних клеток друг от друга [13].
Автолитическая К-ацетилмурамил-£-аланин амидаза Bacillus subtilis W-23 гидролизует собственные клетки и выделенные из них клеточные стенки, содержащие рибиттейхоевую кислоту, и не разрушает клетки другого штамма Bacillus subtilis с глицеринтейхоевой кислотой в составе клеточной стенки [14].
Механизм действия внеклеточных бактерио-литических ферментов на клеточные стенки бактерий-мишеней практически не исследован.
Ранее нами было показано, что бактериолити-ческие ферменты лизоамидазы эффективно разрушают клеточные стенки таких грамположительных бактерий, как Staphylococcus aureus и Streptomyces chryzomallus, в состав которых наряду с пептидогликаном входят рибиттейхоевые кислоты. Ферменты лизоамидазы быстрее гидро-лизуют клеточные стенки S. aureus и S. chryzomallus, содержащие большее количество рибиттей-хоевой кислоты, и не гидролизуют чистый пепти-догликан [1].
Целью этой работы явилось дальнейшее изучение роли анионных полимеров клеточных стенок грамположительных бактерий в механизме действия на них бактериолитических ферментов лизоамидазы.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Микроорганизмы. В работе использовали: Staphylococcus aureus 209-P, Micrococcus luteus ВКМ В1314, Streptomyces chrisomallus ВКМ Ас-628; активный и малоактивный штаммы Lysobacter sp. -продуцента внеклеточного бактериолитического препарата лизоамидаза (Lysobacter sp. XL 1 и Lysobacter sp. XL 2 [4]), Bacillus subtilis W-23, Bacillus subtilis 168 из коллекции лаборатории регуляции биохимических процессов Института биохимии и физиологии микроорганизмов РАН; Staphylococcus epidermidis, Streptococcus mutans, Streptococcus pyogenes из коллекции ГИСК им. Тарасевича;
Bacillus subtilis SA 398 и Bacillus subtilis L 5706 любезно предоставленны профессором Янгом (Уэльский университет, Великобритания).
Получение клеток тест-бактерий для определения активности бактериолитических ферментов лизоамидазы. Клетки S. aureus 209 P выращивали на пептонно-дрожжевой среде при 37°С в течение 24 ч, а затем автоклавировали 30 мин при 2 атм. Клетки осаждали центрифугированием при 5000 g 20 мин, трижды промывали 10 мМ mpuc-HCl буфером, рН 8.0 и лиофильно высушивали.
Клетки M. luteus выращивали на пептонно-дрожжевой среде при 37°С в течение 16 ч, осаждали центрифугированием, трижды промывали 10 мМ mpuc-HCl буфером, рН 8.0 и лиофильно высушивали.
B. subtilis W-23, B. subtilis 168, B. subtilis SA 398 и B. subtilis L 5706 выращивали при 37°С в течение 16 ч на среде 5/5, разработанной в ИБФМ РАН, следующего состава: аминопептид - 6%, триптон -0.5%, дрожжевой экстракт - 0.1%, экстракт сои -3%, рН 7.2. При этом клеточные стенки бактерий содержат тейхоевые кислоты.
B. subtilis W-23 и B. subtilis 168 выращивали также при 37°С в течение 48 ч на среде с ограниченным содержанием фосфата следующего состава: NaH2PO4 ■ 2Н20 - 1.5 мМ; (NH4)2SO4 - 50 мМ; K2SO4 - 30 мМ; цитрат - 1.0 мМ; MgCl2 ■ 6H2O -1.25 мМ; CaCl2 - 0.1 мМ; FeCl3 - 0.1 мМ; ZnCl2 -25 мкМ; MnCl2 ■ 4H2O - 25 мкМ; CuCl2 - 5 мкМ; CoCl2 ■ 6H2O - 5 мкМ; Na2MoO4 ■ 2H2O - 5 мкМ; глюкоза - 30 г/л. Клеточные стенки таких бактерий (B. subtilis W-23* и B. subtilis 168*) содержат тейху-роновые кислоты [15].
Клетки осаждали центрифугированием при 5000 g 20 мин, трижды промывали 10 мМ mpuc-HCl буфером, рН 8.0 и лиофильно высушивали.
Выделение и очистка ферментов лизоамида-
зы. Бактериолитический препарат лизоамидазу получали из культуральной жидкости Lysobacter sp. XL 1, выращенного на опытно-технологической установке Института биохимии и физиологии микроорганизмов РАН (Пущино) [8].
Бактериолитическую эндопептидазу Л1 получали из препарата лизоамидаза методами гель-фильтрации на сефакриле S-200, ионообменной хроматографии на СМ-сефадексе и хроматографии на колонке Mono S в системе FPLC [5].
Очистку бактериолитической пептидазы Л2 и мурамидазы проводили из культуральной жидкости Lysobacter sp. XL 2, выращенного на среде 5/5, по схеме, включающей ионообменную хроматографию на СМ-сефадексе и ДЕАЕ-Toyopearl и гель-фильтрацию на Toyopearl HW-50F [4].
Определение бактериолитической активности ферментов лизоамидазы. К 0.5 мл суспензии кле-
ток (клеточных стенок, пептидогликана) в концентрации 1 мг/мл в 10 мМ mpuc-HCl буфере, рН 8.0 добавляли 100 мкл лизоамидазы (1 мг/мл), или гомогенного фермента: пептидазы Л1 (10 мкг/мл), пептидазы Л2 (4 мкг/мл), мурамидазы (50 мкг/мл) в 10 мМ mpuc-HCl буфере, рН 8.0. Реакцию проводили в течение 15—30 мин при 37°С. За единицу бактериолитической активности (ЛЕ) принимали такое количество фермента, которое приводило к снижению оптической плотности бактериальной суспензии, измеренной при 540 нм, на 0.01 ед. за 1 мин.
Получение клеточных стенок B. subtilis W-23*.
Клеточные стенки получали по методу Шарона в модификации Шоу [16]. Для этого клетки B. subtilis W-23*, трижды отмывали десятикратным объемом 0.1 М фосфатного буфера, pH 6.8 центрифугированием (5000 g, 15 мин), замораживали при -42°С и разрушали на пресс-дезинтеграторе. К гомогенату добавляли дНКазу и РНКазу (каждую в конечной концентрации 20 мкг/мл). Неразрушенные клетки удаляли центрифугированием (1200 g, 15 мин). Фракцию клеточных стенок осаждали (10000 g, 15 мин) и четыре раза отмывали холодным 10 мМ mpuc-HCl буфером, рН 7.2 (10000 g, 15 мин). Для инактивации автолитичес-ких ферментов фракцию клеточных стенок выдерживали на водяной бане 15 мин при 100°С, затем суспендировали в 50 мл 10 мМ mpuc-HCl, рН 8.0 и инкубировали с трипсином (100 мкг/мл) 3 ч, 37°С. Полученный препарат клеточных стенок трижды отмывали водой, суспендировали в 30 мл смеси хлороформ-метанол (2 : 1) для экстракции
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.