НЕЙРОХИМИЯ, 2004, том 21, № 2, с. 100-109
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ РАБОТЫ
УДК 577
РОЛЬ АРАХИДОНОВОЙ КИСЛОТЫ И ЕЕ МЕТАБОЛИТОВ
В ПОРАЖЕНИИ СИНАПТИЧЕСКИХ МЕМБРАН ПРИ ДЕЙСТВИИ ГЛУТАМАТА НА НЕРВНЫЕ ОКОНЧАНИЯ ИЗ РАЗНЫХ ОБЛАСТЕЙ МОЗГА КРЫС
© 2004 г. С. М. Молчанова, Н. Ю. Новоселова, Ю. Ю. Тюрина, И. О. Захарова,
Л. А. Юрлова, Н. Ф. Аврова*
Институт эволюционной физиологии и биохимии им. И.М. Сеченова РАН, Санкт-Петербург
Увеличение внеклеточного содержания глутамата в ткани мозга и избыточная стимуляция его рецепторов лежат в основе поражения и гибели нервных клеток при ишемии и ряде нейродегенера-тивных болезней. Существенно выяснение роли арахидонатного пути образования свободных радикалов в нейротоксических эффектах глутамата. В работе изучали эффект глутамата и ингибиторов ферментов, продуцирующих и метаболизирующих арахидоновую кислоту, на активность Na+,K+-АТФазы и накопление продуктов перекисного окисления липидов в синаптосомах из разных областей мозга крыс. Показано, что инкубация с глутаматом синаптосом коры больших полушарий, стриатума и гиппокампа, но не мозжечка приводит к снижению активности №+,К+-АТФазы и накоплению малонового диальдегида (МДА). Найдено, что при действии на синаптосомы коры мозга и гиппокампа ингибиторы фосфолипазы А2 и циклооксигеназ (квинакрин и индометацин соответственно) достоверно повышают активность №+,К+-АТФазы, сниженную при действии глутамата, и в ряде случаев уменьшают накопление МДА, но при действии на синаптосомы стриатума эффект этих соединений не выражен. Показано, что ротенон (блокатор комплекса I митохондрий) в сочетании с олигомицином (ингибитором АТФ-синтазы митохондрий), предотвращающие образование свободных радикалов и поглощение ионов кальция митохондриями, не защищают мембраны синаптосом разных областей переднего мозга от действия глутамата, напротив, при действии на синаптосомы коры мозга эффект глутамата и этих соединений аддитивен. При этом эффект одного роте-нона менее выражен, чем его эффект в сочетании с олигомицином. По-видимому, на ранних этапах ишемического воздействия арахидонатный путь образования свободных радикалов вносит существенный вклад в окислительную инактивацию №+,К+-АТФазы в нервных окончаниях коры мозга и гиппокампа (но не стриатума и мозжечка), а накопление ионов кальция в митохондриях выполняет защитные функции, препятствуя чрезмерной активации ферментов цитозоля, продуцирующих активные формы кислорода.
Ключевые слова: глутамат, арахидоновая кислота, Иа+,К+-АТФаза, малоновый диалъдегид, синаптосомы, кора головного мозга, стриатум, гиппокамп, мозжечок.
ВВЕДЕНИЕ
Известно, что избыточные внеклеточные концентрации возбуждающего нейротрансмиттера глутамата токсичны и вызывают дегенерацию нейронов [1]. В настоящее время "эксайтотоксич-ность" считается одним из главных факторов, определяющих поражение нервной ткани при инсультах и острой сердечной недостаточности. Клинические исследования, однако, показали неэффективность применения антагонистов глута-матных рецепторов при лечении этих заболеваний [2]. Поэтому исследование механизмов нарушения метаболизма, приводящих к гибели нейронов в условиях эксайтотоксичности, является актуаль-
* Адресат для корреспонденции: 194223 Санкт-Петербург, пр. М. Тореза, д. 44; факс: (812) 552-30-12; e-mail: avrova@ liephb.ru
ным при разработке новых методов лечения ишемии головного мозга.
При действии избыточных концентраций глутамата вход кальция через ионотропные глутамат-ные рецепторы является инициатором обменных процессов, приводящих к устойчивому повышению внутриклеточного содержания свободного кальция [1, 3]. Это приводит к активации кальций-зависимых протеаз, фосфолипаз и эндонуклеаз, аккумуляции свободных радикалов в клетке, и как следствие, к инициации программ апоптоза или к некрозу. В результате кальций-зависимых реакций происходит образование ряда биологически активных веществ, одним из которых является арахидоновая кислота.
Свободный арахидонат образуется в результате расщепления фосфолипидов фосфолипазой А2
и служит субстратом для циклооксигеназ и ли-поксигеназ, продуктом реакции которых являются простагландины и другие биоактивные эйкоза-ноиды - тканевые гормоны широкого спектра действия. Каскад реакций арахидоновой кислоты в центральной нервной системе связан с работой глутаматэргических синапсов, в частности, стимулируется взаимодействием агонистов с NMDA (N-methyl-d-aspartate) рецепторами, метаболиты арахидоновой кислоты участвуют в процессах си-наптической пластичности [4], а свободный ара-хидонат усиливает действие глутамата, ингиби-руя глутаматные переносчики [5, 6]. Ранее было показано, что ишемия нервной ткани сопровождается значительным увеличением содержания свободных жирных кислот, в том числе арахидона-та [7, 8]. При патологии избыточные концентрации глутамата интенсифицируют образование и метаболизм арахидоновой кислоты посредством кальций-зависимой активации ферментативных реакций [9] и синтеза ферментов de novo [10, 11].
Превращения арахидоновой кислоты, инициируемые действием глутамата на нервные клетки, являются одним из источников свободных радикалов, вызывающих повреждение клеточных мембран. Так, действие фосфолипазы А2 высвобождает жирные кислоты из липидов мембраны и делает их более доступными для перекисного окисления [9, 12]. При действии циклооксигеназ и липооксигеназ в качестве побочного продукта превращений арахидоната образуется супероксид-анион [13]. В патологических условиях активация этих ферментов может вносить существенный вклад в образование активных форм кислорода.
В патологических для клетки условиях митохондрии вносят большой вклад в образование активных форм кислорода [14], в частности супероксидного анион-радикала, которое может происходить из-за утечки электронов с транспортной цепи на кислород. В нормальных условиях такая утечка нейтрализуется системой антиоксидант-ной защиты клетки, однако дефекты в электрон-транспортных комплексах или изменения мембранного потенциала значительно усиливают образование свободных радикалов в митохондриях. Так, повышенные концентрации арахидоновой кислоты, приводящие к частичному разобщению окисления и фосфорилирования [15], вызывают повышенную генерацию свободных радикалов в митохондриях.
Синаптосомы - адекватная модель для изучения ранних этапов воздействия возбуждающих аминокислот, не связанных с индукцией экспрессии генов [16]. Кроме того, такая модель позволяет сравнивать ответы нервных окончаний различных областей мозга на токсичные концентрации глутамата [17].
Цель настоящего исследования - сравнительная оценка вклада арахидонатного пути образования свободных радикалов в поражение синап-тических мембран при действии глутамата на нервные окончания из разных областей мозга. Для этого проведено изучение влияния ингибиторов фосфолипазы А2 и циклооксигеназ на активность №+,К+-АТФазы и накопление одного из продуктов перекисного окисления липидов (ПОЛ) в синаптосомах из разных областей мозга крыс, подвергнутых действию глутамата. Для оценки того, какую роль в токсических эффектах глутамата играет взаимодействие арахидоновой кислоты с митохондриями, исследовалось влияние на изученные показатели ротенона (ингибитора комплекса I митохондрий) и олигомицина (ингибитора АТФ синтазы митохондрий).
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
В работе использовали ротенон, олигомицин, квинакрин, индометацин, L-глутамат, АТФ, пиру-ваткиназу и лактатдегидрогеназу ("Sigma", США); NADH ("Serva", Германия) и 2-тиобарбитуровую кислоту ("Merk", Darmstadt, Германия). Остальные химические препараты были отечественного производства - хч или чда.
Опыты проводили на крысах-самцах линии Wistar (150-180 г). Животных убивали декапита-цией. Неокортекс, стриатум, гиппокамп и мозжечок выделяли согласно атласу [18]. Выделение синаптосом проводили по методу Хайоша с модификациями [19]. Ткань исследуемых областей мозга очищали от сосудов и гомогенизировали в 10 объемах 0.32 М сахарозы на 40 мМ трис-НС1 (рН 7.4). Все процедуры проводили при 4°С. Полученный гомогенат центрифугировали 10 мин при 1500g. Осадок ресуспензировали в исходном растворе и вновь центрифугировали в тех же условиях. Объединенный супернатант центрифугировали 20 мин при 20000g. Полученный осадок представлял собой неочищенные синаптосомы (фракция Р2). Для выделения синаптосом использовали модифицированный метод Хайоша [19]. Фракцию Р2 наносили на градиент плотности сахарозы (1.2, 0.8 и 0.32 М сахароза в 40 мМ трис-НС1) и центрифугировали при 20000g в течение часа. Фракцию синаптосом, образовавшуюся на границе 0.8 и 1.2 М растворов сахарозы, отбирали пастеровской пипеткой и дважды промывали 40 мМ трис-НС1 (рН 7.4), центрифугируя каждый раз по 10 мин при 20000g.
Активность №+,К+-АТФазы оценивали по сопряженной реакции в присутствии избытка пиру-ваткиназы, лактатдегидрогеназы и фосфоэнол-пирувата, регистрируя скорость убыли NADH в среде инкубации [20, 21]. В работе использовали спектрофотометр Спекорд М-40 ("Karl Zeisse",
Таблица 1. Влияние глутамата и квинакрина на активность №+, К+-АТФазы и содержание МДА в синапто-сомах коры больших полушарий, гиппокампа, стриа-тума и мозжечка, % от контрольных значений
Активность Содержание
Условия №+, К+- ТБК-реактив-
АТФазы ных веществ
Контроль Глутамат Глутамат +
Контроль Глутамат Глутамат +
Контроль Глутамат Глутамат +
Кора больших полушарий 100 82.1 ± 4.1а квинакрин 92.3 ± 2.3Ь Гиппокамп 100 74.4 ± 4.9а квинакрин 80.5 ± 5.7Ь Стриатум 100 72.7 ± 2.6а квинакрин 79.2 ± 1 Мозжечок
100
121.3 ± 5.1а 87.2 ± 6.7Ь
100
117.5 ± 4.1а 107.1 ± 5.3Ь
100
135.4 ± 7.5а
125.6 ± 9.7
Контроль 100 100
Глутамат 91.1 ± 4.6 100.6 ± 6.0
Глутамат + квинакрин 62.6 ± 15.0Ь 87.7 ± 3.9
Примечание. Данные представлены как М ± 8.Е.М; п = 4-6. Концентрация глутамата в пробах составляла 1 мМ, квинакрина - 50 мкМ. Активность №+, К+-АТФазы в контрольном си-наптосомах была принята за 100%, она составляла 19.5 ± 1.7 в синаптосомах коры мозга, 16.7 ± 1.8 в синаптосомах гиппокампа, 14.5 ± 0.9 в синаптосомах стриатума, 20.4 ± 1.6 мкмоль Фн/мг белка/ч в синаптосомах м
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.