УСПЕХИ СОВРЕМЕННОЙ БИОЛОГИИ, 2007, том 127, № 1, с. 44-49
УДК 576.8.095.38:576.893.1
РОЛЬ АССОЦИАЦИИ ПРОСТЕЙШИХ TETRAHYMENA PYRIFORMIS И БАКТЕРИЙ BURKHOLDERIA CEPACIA В ФОРМИРОВАНИИ БИОПЛЕНОК
© 2007 г. А. А. Каминская, В. И. Пушкарева, С. А. Ермолаева, Т. В. Степанова,
Н. В. Алексеева, А. Л. Андреев
Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи РАМН, Москва
Изучали способность бактерий Burkholderia cepacia различных штаммов в ассоциации с инфузориями Tetrahymena pyriformis формировать биопленки в искусственной среде и модельной, приближенной к естественной. Качественная (визуальная) оценка сформировавшихся биопленок показала, что исходный штамм B. cepacia и мутант Bf++ во всех средах (LB-бульон, LB/ПБ и почвенная вытяжка) при начальной концентрации 106-107 клеток в 1 мл при температуре 28°С образовывали биопленки, тогда как мутант Bf-, дефектный по способности формировать биопленки, ни в одной среде не проявлял этого признака. Простейшие стимулировали этот процесс во всех вариантах опытов, не исключая и ассоциацию с мутантом Bf-. Максимальное накопление биопленок наблюдали в LB-бульо-не, среднее - в смеси LB/ПБ и слабое - в почвенной вытяжке. Численность инфузорий снижалась в ассоциациях с исходным штаммом и мутантом Bf++ с 105 до 103 особей в 1 мл. Напротив, при взаимодействии с мутантом Bf- простейшие достигали максимальной концентрации 2 х 105 особей в 1 мл. Сформировавшиеся биопленки могут служить дополнительным резервуаром B. cepacia в природных экосистемах.
Почвенные и водные биоценозы включают популяции прокариотических и эукариотических организмов, функционирующих как единое целое с многообразными и неоднозначными связями. С 80-х годов XX века внимание исследователей привлекло явление, давно известное в микробиологии как "фиксированная" форма существования бактерий, в том числе и патогенных, как на неживых субстратах, так и в различных ассоциациях: с водорослями, ризосферой растений, простейшими, ракообразными и другими организмами [2, 6, 11, 13, 24]. В англоязычной литературе этот феномен стал описываться как "биопленки".
Сканирующая лазерная микроскопия позволила наблюдать за развитием биопленочных сообществ, прикрепленных к субстратам естественного и искусственного происхождения [14, 15].
Изучение экологических аспектов формирования биопленок дает возможность выявить роль абиотических (состав сред, температура, рН) и биотических (простейшие) факторов в реализации данной стратегии существования микроорганизмов в природе, что особенно важно для возбудителей сапронозных инфекций, способных обитать в почвах и водоемах [3-5, 8]. В первом ряду оказались весьма значимые для инфекционной патологии микроорганизмы - легионеллы, псевдомонады и холерные вибрионы, однако и другие бактерии - кампилобактеры, клебсиеллы, сальмонеллы, листерии - также привлекли внимание
исследователей способностью формировать биопленки [12, 18, 20, 22, 23, 25-27].
Burkholderia cepacia и близкородственная им Pseudomonas aeruginosae являются патогенными для человека, вызывая инфекции у иммуноком-прометированных больных, а также у пациентов, при лечении которых использовали имплантаты: искусственные клапаны сердца, линзы и другие эндопротезы. Установлено, что бактерии способны колонизировать поверхности этих материалов, образуя биопленки [15-17]. В природных экосистемах участие B. cepacia в формировании биопленок неизвестно.
Доказано, что B. cepacia имеют тесные биоце-нотические связи с почвенными и водными простейшими (амебами, инфузориями) - основными природными хозяевами многих потенциально патогенных бактерий [7-10, 19, 21]. Не исключено, что свободноживущие простейшие в биопленочных сообществах могут занимать особый функциональный статус, однако эта их экологическая ниша пока остается неизвестной.
Цель данной работы - изучение способности инфузорий Tetrahymena pyriformis в ассоциации с Burkholderia cepacia различных штаммов формировать биопленки в искусственной и модельной, приближенной к естественной средах.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
В экспериментах использована группа изоген-ных штаммов B. cepacia, различающихся по способности формировать биопленки:
- исходный штамм B. cepacia 370, геномовар IIIa типа с умеренной способностью формировать биопленки, а также его мутанты, полученные методом инсерционного мутагенеза [26];
- Bf++ - с повышенной способностью формирования биопленки;
- Bf— дефектный по способности формировать биопленки.
Бактериальные культуры выращивали в ага-ризованной среде Luria-Bertani (LB) при 28°C; мутанты - c добавлением канамицина 100 мкг/мл и ампициллина 100 мкг/мл.
Биохимическую активность штаммов B. cepacia проводили на тест-системах API 20 NE (BIO-Merieux, Франция) и в ПЦР, которую ставили с парой праймеров Eub 16-1 (5'-AGGGTTGGAT-TCTGGCTCAG-3') и CeMu Vi 16-2 (5'-CCGACTG-TATTAGAGCCA-3') для выявления последовательности 16S и 23S рибосомальной РНК длиной 463 п.н.
Аксеническую культуру инфузорий Tetrahy-mena pyriformis (штамм GL из коллекции НИИЭМ им. Гамалеи) культивировали, как описано ранее [10].
Совместное культивирование буркхолдерий и простейших (микробная нагрузка 100 клеток микробов на 1 особь) проводили при 28°С в различных средах:
- в LB-бульоне;
- в смешанной среде - LB + почвенная вытяжка (в соотношении 1 : 1);
- в водной почвенной вытяжке (иловато-болотная почва Приокского заповедника).
Для контроля служили те же среды, содержащие B. cepacia соответствующих штаммов (без инфузорий), а также аксеническая культура простейших.
Биопленки получали в плоскодонных пластиковых планшетах для иммуноферментного анализа емкостью 3 мл. Для этого ночные культуры исследуемых штаммов разводили в соответствующей для каждого эксперимента свежей среде до концентрации 107 клеток в 1 мл. Полученные суспензии стерильно вносили по 1.2 мл в лунки планшета (6 лунок для каждого штамма), затем в эти же лунки добавляли культуру T. pyriformis (105 особей в 1 мл) в том же объеме. В контрольные лунки вносили раздельно культуры бактерий и инфузорий. Планшету помещали в термостат при 28°С, и образцы исследовали в динамике -от 24 до 72 ч.
Оптическую плотность планктонной субпопуляции бактерий определяли на фотометре iEMS Reader MF "Labsystems" (Швеция) при длине волны 540 нм. В определенные интервалы времени содержимое всех лунок осторожно отсасывали, заполняли их 2.4 мл дистиллированной воды с 250 мкл 1%-ного спиртового раствора кристалл-виолета и инкубировали при комнатной температуре в течение 45 мин. Затем краситель отсасывали и лунки троекратно промывали дистиллированной водой. В отмытые от несвязавшейся краски лунки вносили по 3 мл этилового спирта и оставляли на 45 мин при комнатной температуре. Полученный раствор в 4-кратной повторности переносили в лунки иммунологической планшеты меньшей емкости - 300 мкл. Количество сформировавшейся биопленки оценивали фотометрически по интенсивности окрашивания спирта. Фоновые показатели регистрировали в лунках, содержащих "чистые" питательные среды и культуру простейших. Опыты повторяли трижды.
Количество планктонных бактерий регистрировали фотометрически и бактериологически, а инфузорий - микроскопией в камере Горя-ева (микроскоп Amplival, увеличение х20).
Статистическую обработку осуществляли по программе Ехсе1 2000 (Microsoft Inc., 1999), Sta-tistica for Windows v 5.0 (Statsoft Inc., 1995).
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
Клетки B. cepacia исходного штамма и производных мутантов по культуральным, морфологическим, биохимическим, цитопатогенным свойствам и способности к пигментообразованию не различались.
Использование трех сред культивирования -искусственной, оптимальной для формирования биопленки (LB-бульон), смешанной (LB + почвенная вытяжка) и приближенной к естественной (почвенная вытяжка) - диктовалось необходимостью оптимизировать популяции буркхолдерий и тетрахимен к условиям одновременного существования и вместе с тем не только визуально оценивать формирование биопленок, но и проводить количественный учет их биомассы.
Все пробы инкубировали при 28°С - температуре, являющейся верхним пределом оптимума для инфузорий и наиболее благоприятной для размножения буркхолдерий.
Качественная оценка сформировавшихся биопленок. Получены биопленки в разных культу-ральных средах, через сутки они были весьма слабые в отсутствие простейших и более заметные в ассоциации. При визуальной оценке через 2 сут в большинстве лунок отмечали наличие сформировавшихся (зрелых) биопленок, причем простейшие явно стимулировали этот процесс. В LB-бу-
Способность разных штаммов Burkholderia cepacia к формированию биопленок в ассоциации с простейшими и в их отсутствие
Варианты опытов, штаммы Эффект
LB LB/ПВ ПВ
1. T. pyriformis + B. cepacia 370 (исходный) ++++ +++ ++/+
2. B. cepacia 370 (исходный) ++ ++/+++ +
3. T. pyriformis с мутантом Bf++ +++++ ++++ ++/+
4. Bf++ ++++ +++/++++ +
5. T. pyriformis с мутантом Bf- ++ ++/+ +
6. Bf- - - -
Примечание: LB - LB-бульон; LB/ПВ - LB + почвенная вытяжка; ПВ - почвенная вытяжка.
льоне накопление биомассы оказалось наибольшим, в смеси бульона с почвенной вытяжкой -умеренным и в почвенной вытяжке - наименее выраженным. При этом буркхолдерии всех исследуемых штаммов, в том числе и мутанта, дефектного
Оптическая плотность, ед. 1.0 г
0.9 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2( 0.1 0
А
2
о1
А3
3
А
/.01 / ''>2
18 36 54
Время инкубации, ч
72
Рис. 1. Динамика численности планктонных субпопуляций буркхолдерий в LB-бульоне при 28°С: А - в ассоциации с простейшими; Б - без простейших; 1 -370 исходный, 2 - Bf ++, 3 - В£
по способности формировать биопленки в сообществе с простейшими, вели себя сходным образом и образовывали более интенсивную биопленку (таблица).
Известно, что популяции бактерий и простейших, участвующих в процессе формирования биопленок, состоят из свободно плавающих (планктонных) особей и фиксированных в экзо-полисахаридном матриксе форм [22, 23].
В ходе экспериментов оценивали динамику численности планктонных субпопуляций бактерий и инфузорий. При культивировании в ЬВ-бульоне и смеси ЬВ + п
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.