научная статья по теме РОЛЬ АТP-ЗАВИСИМОГО КАЛИЕВОГО КАНАЛА В АКТИВАЦИИ ЦИКЛА К+ В МИТОХОНДРИЯХ ПЕЧЕНИ КРЫС Биология

Текст научной статьи на тему «РОЛЬ АТP-ЗАВИСИМОГО КАЛИЕВОГО КАНАЛА В АКТИВАЦИИ ЦИКЛА К+ В МИТОХОНДРИЯХ ПЕЧЕНИ КРЫС»

БИОЛОГИЧЕСКИЕ МЕМБРАНЫ, 2014, том 31, № 1, с. 44-49

УДК 577.3+578.61

РОЛЬ АТP-ЗАВИСИМОГО КАЛИЕВОГО КАНАЛА В АКТИВАЦИИ ЦИКЛА К+ В МИТОХОНДРИЯХ ПЕЧЕНИ КРЫС

© 2014 г. О. С. Горбачёва1, 2, Д. А. Мошков1, 2, Н. И. Венедиктова1, Г. Д. Миронова1, 2*

Институт теоретической и экспериментальной биофизики РАН, 142290, Московская обл., Пущино, Институтская, 3; *электронная почта: mironova40@mail.ru 2Пущинский государственный естественно-научный институт, 142290, Московская обл., Пущино, пр. Науки, 3 Поступила в редакцию 21.05.2013 г.

Митохондриальный АТР-зависимый калиевый канал (митоКАХР) играет ключевую роль в защите миокарда при ишемии. Предполагается, что механизм этой защиты связан с активацией калиевого цикла в митохондриях. В представленной работе впервые получены прямые доказательства существования цикла K+ в митохондриях, связанного с функционированием митоКАТР. Активация этого цикла зарегистрирована по изменению оптической плотности суспензии митохондрий в виде двух-трех волн набухания — сокращения органелл. С помощью активаторов и ингибиторов митоКАТР доказано, что существенная роль в осуществлении калиевого цикла принадлежит каналу. Обнаружено, что силденафил in vitro влияет непосредственно на митоКАТР, являясь его активатором. Предполагается, что обнаруженное ранее кардиопротекторное действие силденафила связано с активацией митоКАТР. С целью изучения структуры и объемных изменений митохондрий на различных этапах работы цикла калия в присутствии модуляторов изучаемого канала проведена электронная микроскопия препаратов митохондрий. Обнаружена корреляция между снижением оптической плотности и набуханием митохондрий. Полученные данные позволяют предложить механизм участия ми-тоКАТР в защите тканей от гипоксических повреждений.

Ключевые слова: митохондрии, митохондриальный АТР-зависимый калиевый канал, кардиопро-текция, 4-аминопиридин, силденафил, цикл K+.

Б01: 10.7868/80233475514010058

В настоящее время внимание большого числа исследователей в области биоэнергетики и медицины привлечено к изучению митохондриально-го АТР-зависимого канала (митоКАТР), который играет ключевую роль в защите миокарда при ишемии [1, 2]. Показано, что введение животным фармакологических и метаболических активаторов митоКАТР непосредственно перед продолжительной ишемией оказывает эффект, подобный ишемическому прекондиционированию, а введение ингибиторов канала предотвращает эффекты как прекондиционирования, так и активаторов канала [2—4]. Однако механизм этой кардиопро-текции до сих пор не выяснен. В нашей лаборатории предположили, что механизм защиты миокарда при ишемии, опосредованный стимуляцией работы митоКАТР, связан с активацией цикла К+ в митохондриях [5]. Следует отметить, что усиление К+/Н+-обмена, которое должно наблюдаться во время работы калиевого цикла, было обнаружено ранее с использованием валиноми-цина [6].

Активация этого цикла должна приводить к слабому разобщению, так как ведет к небольшому снижению мембранного потенциала. Известно, что снижение на 10% потенциала на внутренней мембране митохондрий приводит к уменьшению образования перекисей в них на 70% [7]. Учитывая сказанное, мы полагаем, что активация калиевого цикла в митохондриях является необходимым звеном в защите сердца от накопления активных форм кислорода (АФК), предупреждения деградации мембран и снижения энергетического баланса в ишемизированном миокарде. Данная работа посвящена получению доказательству существования цикла К+ в митохондриях, поскольку экспериментальные данные до сих пор отсутствуют.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Митохондрии из печени самцов крыс линии Щ81аг выделяли общепринятым методом дифференциального центрифугирования с модифика-

циями, разработанными в нашей лаборатории [8]. Вход ионов калия определяли по скорости набухания митохондрий в гипотонической среде (50 мМ KCl). Кинетику набухания регистрировали на спектрофотометре UV-2450(PC) (Shimadzu, Япония) по изменению оптической плотности суспензии митохондрий при длине волны 520 нм, постоянном перемешивании и термостатирова-нии при 26°С. Набухание митохондрий инициировали добавлением 5 мМ сукцината в присутствии 2 мкМ ротенона. Концентрация митохон-дриального белка в ячейке составляла 0.2 мг/мл. Модуляторы митоКАХр (АТР, 4-аминопиридин, АDP, силденафил (Sigma-Aldrich, США)) добавляли в среду инкубации в необходимых количествах перед внесением митохондрий. Для определения цикла K+ в митохондриях регистрацию вели в течение 30 мин, субстрат дыхания вносили через 100 с после митохондрий. Скорость набухания рассчитывали по изменению светорассеяния за единицу времени. Недавно с помощью специфической флуоресцентной метки было доказано, что регистрация набухания в описанных выше условиях отражает вход калия в митохондрии [9].

Дыхание митохондрий измеряли полягрогра-фическим методом с помощью оксиграфа (Oroboros Oxigraph-2K, Австрия). Фосфорилиро-вание инициировали добавлением в среду инкубации митохондрий 200 мкМ АОР. Разобщение митохондрий инициировали добавлением 50 мкМ 2,4-динитрофенола (ДНФ). Эксперименты проводили в закрытой ячейке при постоянном перемешивании и термостатировании при температуре 25—26°С.

Электронную микроскопию митохондрий проводили на микроскопе Tesla BS-500 (Tesla, Чехословакия). Образцы для электронной микроскопии фиксировали в течение 2 ч в 2.5% глутаро-вом альдегиде, растворенном в среде выделения (pH 7.4) и постфиксировали в 1% оксиде осмия (OsO4).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Выявление цикла K+ в митохондриях печени крыс. Известно, что в присутствии калиевого ионофора валиномицина, который транспортирует калий с высокой скоростью, после набухания митохондрий наблюдается их сокращение [6]. В митохондриях энергозависимый вход калия осуществляется с гораздо меньшей скоростью, чем в присутствии валиномицина, поэтому для регистрации калиевого цикла следует выбирать другие временные характеристики. Мы увеличили время регистрации набухания митохондрий по изменению оптической плотности до 30—40 мин. В этих условиях было зарегистрировано не только набухание, но и сокращение органелл. Этот фе-

ЯК

Время, с

Рис. 1. Энергозависимый вход калия в митохондрии печени крыс. Регистрация в течение 30 мин. Среда инкубации содержала 50 мМ KCl, 5 мМ NaH2PO4, 0.1 мМ EGТА, 5 мкМ цитохрома с, 10 мМ HEPES-^ОН (pH 7.4). Набухание митохондрий инициировали добавлением 5 мМ сукцината (ЯК) в присутствии 2 мкМ ротенона. Концентрация митохондриального белка в ячейке составляла 0.2 мг/мл.

номен в гипотонических условиях проявлялся лучше, чем в изотонических (данные не приведены).

На рис. 1 видно, что в подобранных условиях набухание—сокращение митохондрий выражалось в виде двух—трех волн. Такое поведение митохондрий отражает, вероятно, синхронизацию входа и выхода ионов калия в части органелл. Таким образом, в нашей работе впервые получены экспериментальные доказательства существования цикла K+ в митохондриях.

Поскольку вход калия в митохондрии является энергозависимым процессом, была проведена серия опытов по изучению влияния степени сопряжения дыхательной цепи митохондрий на калиевый цикл. Для этого были созданы условия старения митохондрий без субстрата в течение 1.5, 4 и 7 мин, что обычно приводит к снижению степени сопряжения дыхательной цепи митохондрий. Установлено, что старение митохондрий приводит к усилению в них свободного окисления (рис. 2а) и снижению дыхательного контроля (рис. 2в). При этом скорость сопряженного дыхания в ответ на добавку АОР изменяется незначительно (рис. 2б). Изучение набухания митохондрий показало, что при запуске реакции субстратом через 1.5 мин колебания набухания—сокращения органелл выражены лучше, чем при 7-мин инкубации без субстрата. Таким образом, калиевый цикл в митохондриях зависит от состояния сопряжения дыхательной цепи.

Влияние модуляторов калиевых каналов на цикл K+ в митохондриях печени крысы. С целью выяснения вовлечения митоКАТР в наблюдаемые колебания иона калия была поставлена задача

К 1.5 мин 4 мин 7 мин

Рис. 2. Скорость поглощения кислорода митохондриями печени крыс. Дыхание митохондрий печени крысы в состоянии 2 (а); дыхание митохондрий печени крысы в состоянии 3 (б); показатель дыхательного контроля (в). Среда инкубации митохондрий печени содержала: 50 мМ KCl; 0.1 мМ EGTA; 5 мМ NaH2PO4; 10 мМ HEPES; рН 7.4; 1 мг белка митохондрий на 1 мл. Субстрат дыхания (5 мМ сукцинат) вносили в среду перед добавлением митохондрий в присутствии 1 мкМ ротенона.

изучить влияние модуляторов этого канала на калиевый цикл в митохондриях. Для доказательства связи волн набухания—сокращения митохондрий с работой митоКАТР проведена серия экспериментов с использованием ингибиторов и активаторов данного канала. В качестве ингибиторов канала использовали АТР и 4-аминопиридин. В работе применяли физиологические концентрации АТР (1 мМ). В наших экспериментах добавление АТР-М§2+ приводило к снижению набухания митохондрий, что, вероятно, связано с ингибирова-нием энергозависимого входа калия (рис. 3а). При этом не обнаружено циклических изменений объема митохондрий.

В следующей серии экспериментов предполагалось проверить, действительно ли наблюдаемые нами волны набухания—сокращения орга-нелл связаны с транспортом в них ионов калия, и направленно ли действует АТР в этих условиях на

митоКАТР. С этой целью использовали блокатор калиевых каналов 4-аминопиридин (4-АП), который ингибирует митоКАТР наравне с АТР [10]. Установлено, что при добавлении в среду инкубации 5 мМ 4-АП наблюдается выраженный эффект ингибирования, что видно на рис. 3б. Таким образом, регистрируемое нами набухание действительно отражает вход ионов калия в митохондрии, связанный с работой митоКАТР.

В качестве активатора канала мы использовали АDP, который в условиях нашего эксперимента (рис. 4а) в концентрации 500 мкМ повышает скорость АТР-зависимого набухания митохондрий на 85%. Как показано нами ранее, именно эта концентрация АDP активирует реконструированный в бислойную липидную мембрану белок, обладающий свойствами селективного АТР-зависимого калиевого канала [11].

500 1000 1500 2000 Вр

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

Показать целиком