ФИЗИОЛОГИЯ РАСТЕНИЙ, 2015, том 62, № 2, с. 195-203
= ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
УДК 581.1
РОЛЬ АУКСИНА И ЦИТОКИНИНА В РЕГУЛЯЦИИ АКТИНОВОГО ЦИТОСКЕЛЕТА ПРОРАСТАЮЩЕГО IN VITRO МУЖСКОГО
ГАМЕТОФИТА ПЕТУНИИ © 2015 г. Л. В. Ковалева, А. С. Воронков, Е. В. Захарова
Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН, Москва Поступила в редакцию 12.05.2014 г.
Прорастающая in vitro пыльцевая трубка, ставшая в последние годы объектом детальных и интенсивных исследований, является моделью для изучения механизмов половой репродукции у высших растений. На прорастающем in vitro мужском гаметофите петунии (Petunia hybrida L.) исследована потенциальная роль актинового цитоскелета (F-актина) в трансдукции гормональных сигналов в прогамной фазе оплодотворения. Впервые установлено, что экзогенные фитогормоны, такие как ауксин (индолил-3-уксусная кислота, ИУК) и цитокинин (кинетин), оказывают влияние на прорастание и полярный рост пыльцевых трубок, что выражается, соответственно, в ускорении и ингиби-ровании этих процессов, а также в реорганизации их актинового цитоскелета. Внесение ИУК в среду культивирования приводило к повышению содержания F-актина в апикальной и субапикальной зонах пыльцевых трубок и, как предполагается, является ответственным за стимуляцию ее полярного роста за счет интенсификации тока цитоплазмы и апикально направленного транспорта везикул. Ингибитор полимеризации актина, латрункулин Б, вызывал нарушения пространственной организации актинового цитоскелета, снижал содержание эндогенной ИУК и, как следствие, тормозил прорастание и/или блокировал полярный рост мужского гаметофита. Кинетин, напротив, ингибировал рост пыльцевых трубок, снижая содержание полимерного актина по всей длине трубки. В присутствии латрункулина Б в пыльцевых трубках содержание цитокининов существенно не отличалось от такового в контроле. Можно предположить, что ауксин и цитокинин включаются в регуляцию полярного роста пыльцевых трубок, влияя на полимеризацию актина и пространственную организацию актинового цитоскелета.
Ключевые слова: Petunia hybrida — мужской гаметофит — полярный рост — F-актин — латрункулин Б — ауксин — цитокинины
DOI: 10.7868/S0015330315020104
ВВЕДЕНИЕ
Всем эукариотическим клеткам свойственно наличие актинового цитоскелета (АЦ), динамичной и сложно организованной структуры, участвующей во многих клеточных процессах, включая внутриклеточный транспорт, рост и деление клеток, движение цитоплазмы и органелл, а также межклеточные взаимодействия. Регуляция всех этих процессов может включать в себя соответствующую модуляцию активности АЦ, которая определяется взаимодействием актин-связанных белков (АСБ) с О-актином и/или Б-акти-ном, приводящим к нуклеации, полимеризации,
Сокращения: АСБ — актин-связанные белки; АЦ — актино-
вый цитоскелет; АФ — актиновые филаменты.
Адрес для корреспонденции: Ковалева Лидия Валентиновна.
127276 Москва, Ботаническая ул., 35. Институт физиологии
растений им. К.А. Тимирязева РАН. Электронная почта:
kovaleva_l@mail.ru
деполимеризации, стабилизации и кэпированию актиновых филаментов (АФ).
Известно, что прорастание пыльцы и поддержание полярного роста пыльцевой трубки, ключевые процессы прогамной фазы оплодотворения у высших растений, требуют как временной, так и пространственной координации многих клеточных функций, в том числе динамической организации элементов АЦ, внутриклеточного транспорта везикул, несущих материал для построения клеточной стенки в ходе экзо- и эдоци-тоза, и транспорта через ее плазматическую мембрану основных физиологически важных ионов, таких как Н+, Са2+ и К+ [1-10].
Полярный рост пыльцевой трубки базируется на апикально направленном транспорте везикул, который осуществляется за счет функционирования АЦ мужского гаметофита. В качестве ключе-
вого функционального компонента он содержит F-актин, составляющий всего 10% от общего количества актина пыльцевой трубки [3, 11, 12]. АЦ обеспечивает доставку везикул в растущую апикальную зону плазмалеммы благодаря активности АФ, полимеризация которых регулируется АСБ, являющимися ключевыми детерминантами его структуры и динамики и тем самым активными участниками апикального роста трубки.
В настоящее время имеются некоторые основания считать, что АСБ способны действовать как интегратор сигнальных путей, участвующих в механизме регуляции полярного роста пыльцевой трубки, вызывая изменения в структуре актина в ответ на внешние и внутренние сигналы [13, 14]. При этом координация соответствующих процессов, по-видимому, реализуется через активность белка ROP1, который, будучи связанным с RIC3 или RIC4 (ROP-interacting CRIB motif-containing proteins 3 and 4), локализован в апексе пыльцевой трубки. ROP1-зависимая динамика F-актина контролирует полярный рост через пространственно-временную координацию везикулярного транспорта и экзоцитоза. RIC4-медиируемая полимеризация F-актина связана с аккумуляцией везикул в апексе, тогда как RIC3- и Са2+-медии-руемая деполимеризация F-актина индуцирует экзоцитоз в кончике пыльцевой трубки [14]. Кроме Са2+ и ROP ГТФаз в пыльце идентифицированы другие сигнальные молекулы-модуляторы апикального роста пыльцевой трубки (сАМР, фосфоинозитиды, кальмодулин, протеинкиназы, GABA и NO), которые в свою очередь являются мишенями для ключевых сигнальных путей, регулирующих этот процесс путем их взаимодействия с ионами Ca2+ и/или с цитоскелетом при генерации кальциевого сигнала в цитозоле [6, 15].
В настоящей работе сделана попытка выяснить, является ли АЦ мужского гаметофита интегратором сигнальных путей фитогормонов в процессе прорастания и полярного роста пыльцевых трубок. Ранее было показано, что прорастание пыльцевых зерен in vitro и in vivo сопровождается заметными изменениями в уровне эндогенных фитогормонов (ауксина, абсцизовой кислоты, гиббереллинов и цитокининов) и чувствительно к действию экзогенных фитогормонов [16—20]. В частности, обнаружено, что экзогенные ИУК, АБК и ГК3 способны стимулировать прорастание пыльцы и рост пыльцевых трубок петунии, а также выявлены существенные различия в гормональном статусе системы пыльца—пестик после самосовместимого и самонесовместимого опылений. Хотя отмеченные выше факты указывают на активную роль фитогормонов в процессах прорастания и роста мужского гаметофита, механизмы действия таких соединений, а также возможность функционирования их как сигнальных
молекул остаются неисследованными. Решение данной проблемы, связанной с выяснением возможности влияния фитогормонов на цитоскелет, представляется нам весьма актуальным для понимания механизмов полярного роста пыльцевых трубок и гормональной регуляции процесса репродукции у высших растений.
В описанных ниже экспериментах, выполненных на прорастающем in vitro мужском гаметофи-те петунии, исследовано действие ингибитора полимеризации актина (латрункулина Б) на прорастание и рост пыльцевых трубок, структуру цитоскелета и уровень эндогенных фитогормонов. Кроме того изучено влияние экзогенных фитогормонов — ауксина, индолилуксусной кислоты (ИУК) и искусственного цитокинина (кинети-на), на пространственную локализацию F-актина в растущей пыльцевой трубке.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Объект исследования. Объектом исследований в настоящей работе служил мужской гаметофит петунии (Petunia hybrida L.) самосовместимого клона, а именно пыльца и прорастающие пыльцевые трубки. Вегетативно размноженные растения были выращены в почвенной культуре при естественном освещении в оранжерее Института физиологии растений. Черенки выращивали в пробирках на агаризованной среде Мурасиге и Скуга в климатической камере (25°C, 16-часовой световой день).
Культивирование пыльцы. Свежесобранную пыльцу культивировали в течение 2 ч в термостате при температуре 26°С на среде, содержащей 0.3 M сахарозу, 1.6 мМ H3BO3, 1.3 мМ Ca(NO3)2, 0.9 мМ KNO3 и 0.8 мМ MgSO4. Ингибитор полимеризации актина латрункулин Б в концентрациях 100, 2 и 0.2 нМ, и экзогенные фитогормоны ИУК и кинетин в концентрациях 10-12 или 10-6 М, вносили в среду после 2 ч прорастания пыльцы и продолжали ее культивирование еще в течение 2 ч. В данной статье представлены данные, полученные при использовании концентрации 10-12 М, поскольку результаты опытов с двумя концентрациями были схожи.
Визуализация F-актина. Проросшую пыльцу (пыльцевые трубки) фиксировали 4% парафор-мальдегидом в актин-стабилизирующем буфере, содержащем 100 мМ Pipes, 1 мМ MgCl2, 1 мМ CaCl2 и 75 мМ KCl (pH 6.9) в течение 1 ч с предварительной вакууминфильтрацией в течение 5 мин [21]. После фиксации образцы трехкратно промывали и проводили пермеабилиза-цию путем обработки в течение 1 ч буфером, содержащим 0.1% Тритон X-100 и 1 мМ ДТТ. Окрашивание F-актина проводили в течение 20 мин с помощью 0.66 мкМ FITC-фаллоидина в
300
250
w
о 200
ю
S 150
<ч о Я
4
g 100
св Я
5 ч
50
ШШУ
(а)
\1
1
Продолжительность культивирования, ч
0
Рис. 1. Влияние латрункулина Б на прорастание, рост и актиновый цитоскелет пыльцевых трубок петунии. а — длина пыльцевых трубок на среде 0.3 М сахароза + 1.6 мМ Н3ВО3 (черные символы) и на среде 0.3 М сахароза + + 1.6 мМ Н3ВО3 + 0.2 нМ латрункулин Б (светлые символы); на вставке — прорастание пыльцевой трубки на среде 0.3 М сахароза + 1.6 мМ Н3ВО3 + 0.2 нМ латрункулин Б; бар = 20 мкм; б — актиновый цитоскелет пыльцевой трубки на среде 0.3 М сахароза + 1.6 мМ Н3ВО3, ИТС-фаллоидин, 0.66 мкМ; бар = 20 мкм; в — деполимеризация Б-актина в пыльцевой трубке после 20-минутного воздействия 100 нМ латрункулина Б; бар = 20 мкм.
фосфатном буфере, содержащем 0.15 M NaCl, 2.7 мМ KCl, 1.2 мМ KH2PO4 и 6.5 мМ Na2HPO4. После окрашивания образцы трехкратно промывали фосфатным буфером.
Образцы исследовали на флуоресцентном микроскопе Axio Imedger D1 (возбуждение 546 ± ± 6 нм, эмиссия 590 нм) и камерой Axio Cam MRc. Длину пыльцевых трубок (не менее 100 образцов) измеряли, используя программу Axio Vizion 4.5. Оборудование и программное обеспечение — "Carl Zeiss" (Германия).
Изображение пыльцевой трубки делили на 8 равных зон по 10 мкм, начи
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.