ПРИКЛАДНАЯ БИОХИМИЯ И МИКРОБИОЛОГИЯ, 2004, том 40, № 5, с. 567-570
УДК: 581.557:581.116:547.458
РОЛЬ ЭКЗОМЕТАБОЛИТОВ В ПРОЦЕССЕ ФОРМИРОВАНИЯ И ФУНКЦИОНИРОВАНИЯ СОЕВО-РИЗОБИАЛЬНОГО СИМБИОЗА
© 2004 г. Е. В. Кириченко, Л. В. Титова, С. Я. Коць
Институт физиологии растений и генетики НАН Украины, г. Киев, 03022;
e-mail: tlv@uninet.ua Поступила в редакцию 27.05.2003 г.
Исследовано влияние различного инокулята специфичного для сои штамма клубеньковых бактерий Bradyrhizobium japonicum 6346 (клетки неотмытые, отмытые от экзогликан-белкового комплекса и в композиции с ним) на формирование и функционирование соево-ризобиального симбиоза. Показано, что добавление к штамму экзополисахарид-белкового комплекса вдвое увеличивало способность микросимбионта к образованию клубеньков, массу клубеньков и их нитрогеназную активность. Клетки B. japonicum 6346, отмытые от экзометаболитов, характеризовались сниженными показателями симбиотической активности по сравнению с исходными.
В формировании бобово-ризобиальных систем принимают участие ряд веществ, продуцируемых симбионтами, к которым относятся и ризо-биальные экзополисахариды (ЭПС). Известно, что внеклеточные полисахариды бактерий могут выступать в роли молекулярных рецепторов микросимбионта, комплементарно связывающих лектины растения-хозяина на начальном этапе формирования корневого клубенька [1], индуцировать образование на корнях растения неактивных по азотфиксации клубеньков при отсутствии бактериального инокулянта [2] и инициировать ростовую активность в корнях, необходимую как для начала процесса клубенькообразования, так и для органогенеза корней [4], служить сигнальными молекулами в процессе развития клубенька [3, 4], влиять на симбиотический потенциал клубеньковых бактерий [3, 5].
Цель работы - изучение влияния экзометаболитов ризобий сои на процесс формирования и функционирования соево-ризобиального симбиоза.
МЕТОДИКА
Объектами исследования были растения сои Glycine max L. (Merr.), сорта Марьяна, селекции Института физиологии растений и генетики HAH Украины, (г. Киев) и медленнорастущие клубеньковые бактерии сои Bradyrhizobium japonicum 6346 - строгий симбионт сои (коллекция Rhizobium ИФРГ HAH Украины, Киев).
Клубеньковые бактерии выращивали при температуре 28°C на агаризованной среде следующего состава (г/л): КИ2РО4 - 0.5; MgSO4 - 0.2; NaCl -0.1; СаСО3 - 0.5; маннит - 10.0; дрожжевой экстракт - 1.0; агар - 16.0, рН среды - 6.5. Культуру бактерий в возрасте 10 сут (время максимального
накопления полисахаридов [6]) смывали физиологическим раствором и центрифугировали при 60000 § в течение 30 мин. Супернатант сливали, а клетки промывали 2 раза физиологическим раствором, центрифугируя при 5500 § 15 мин. Отмытые от внеклеточных полисахаридов (ПС) клетки использовали для инокуляции семян сои в следующих вариантах: 1 - контроль без инокуляции; 2 - инокуляция суспензией бактерий B. japonicum 6346; 3 - инокуляция B. japonicum 6346 с добавлением ЭПС-белкового комплекса, представляющего собой смесь внеклеточных ПС и внеклеточного белка, синтезируемых штаммом [5]; 4 - инокуляция отмытыми клетками штамма B. japonicum 6346.
Изучение роли ризобиальных экзометаболитов в процессе формирования и функционирования соево-ризобиального симбиоза проводили в условиях модельных вегетационных опытов с использованием в качестве субстрата для роста растений речного песка с питательной смесью Гель-ригеля (0.25 нормы азота) [7]. Влажность песка поддерживали на уровне 60% от полной его вла-гоемкости. В каждом сосуде оставляли по 7 растений. Повторность в вариантах 4-кратная.
Перед посевом семена растений стерилизовали 70%-ным этанолом в течение 10 мин. и промывали проточной водой 1 ч., затем проращивали на фильтровальной бумаге во влажной камере на протяжении 2 сут. Проростки обрабатывали ино-куляционными суспензиями из расчета 106 кл./се-мя в течение 30 мин. и высаживали в предварительно простерилизованные 30%-ной Н2О2 керамические сосуды емкостью 3 л. Контролем служил вариант, где семена сои не обрабатывали суспензиями бактерий.
В опытах оценивали способность у ризобий к образованию клубеньков, нитрогеназную актив-
Таблица 1. Способность различных инокуляционных суспензий специфичного к сое штамма В. ¡аротеыт 6346 вызывать образование клубеньков
Вариант Фаза примордиального листа Фаза одного настоящего листа Фаза трех настоящих листьев Фаза бутонизации
клубеньки клубеньки клубеньки масса клубеньки масса
шт. % шт. % шт. % мг % шт. % мг %
Контроль B. japonicum 6346 B. japonicum 6346 + ЭМ B. japonicum 6346 - ЭМ 0.0 ± 0.0 4.7 ± 0.8 9.8 ± 1.0 0.8 ± 0.4 100 209 17 0.0 ± 0.0 19.9 ± 2.0 28.5 ± 1.3 18.5 ± 0.5 100 143 93 0.9 ± 0.3 39.3 ± 2.0 38.8 ± 1.0 27.8 ± 2.2 100 99 71 6.8 ± 2.3 97.8 ± 6.0 84.0 ± 8.5 50.0 ± 3.5 100 86 50 16.7 ± 1.6 44.3 ± 3.8 71.7 ± 2.2 40.5 ± 1.6 100 162 91 160.0 ± 21.4 266.7 ± 15.0 720.7 ± 39.3 191.0 ± 2.1 100 270 72
Примечание. К табл. 1-3; % - к варианту с инокуляцией штаммом B. japonicum 6346; ЭМ - экзометаболиты.
ность клубеньков и эффективность соево-ризо-биального симбиоза. Способность к образованию клубеньков определяли по их количеству на корне растения, нитрогеназную активность - ацетиленовым методом [8] на хроматографе "Chro-matograf-504" (Польша) с пламенно-ионизационным детектором. Ацетиленвосстанавливающую активность измеряли в четерех повторностях и выражали в мкмолях этилена, который образовывался за 1 ч на 1 растение. Эффективность симбиоза определяли по массе корня, массе корневых клубеньков и зеленой массе растений.
Подсчет клубеньков проводили у растений, отобранных на 7, 12 и 21 сут. после появления всходов. Растения отбирали в фазу образования приморди-ального листа (7 сут, отбор I), в фазу одного настоящего листа (12 сут, отбор II) и в фазу трех настоящих листьев (21 сут, отбор III). Нитрогеназную активность клубеньков определяли у растений отбора III и растений, находящихся в фазе бутонизации (отбор IV). Учет прироста биомассы растений (надземной части и корня) проводили на протяжении всего периода вегетации. Статистический анализ результатов проведен по Доспехову [9].
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Анализируя динамику образования корневых клубеньков на сое в разных опытных вариантах, можно отметить, что инокуляция штаммом В. ]аротсит 6346 с дополнительным внесением ЭЙС-белкового комплекса приводила к образованию максимального количества клубеньков (9.8 штук) на корнях растений в фазе развития примордиального листа (табл. 1). Внеклеточный йС-белковый комплекс добавляли к штамму-иноку-лянту в соотношении 1 : 1 без предварительной совместной инкубации. Такой способ инокуляции, как показали наши исследования, усиливал вирулентность штамма в 2 раза (9.8 клубеньков в опытном варианте и 4.7 - в контроле с нативными клетками).
Отмытые от экзогликанов клетки ризобий характеризовались сниженной вирулентностью по сравнению с исходными клетками и на 7 сут роста растений образовывали количество клубеньков, близкое к показателям контроля без инокуляции, а на 12 сут количество клубеньков на корнях растений было на 7% меньше, чем у растений, обработанных полноценными клетками.
Нарастание вегетативной массы растений сои во всех вариантах опыта за 2 нед. роста практически не отличалось от контроля (табл. 1). Это можно объяснить тем, что в питательную смесь Гельригеля вносили 0.25 нормы минерального азота, поэтому одинаковый исходный уровень минерального азотного питания обеспечил в этот период почти одинаковое развитие растений всех вариантов независимо от способов их инокуляции.
У растений сои, отобранных в фазе 3 настоящих листьев сохранялась закономерность процесса образования клубеньков, отмеченная нами на ранних стадиях развития растений (табл. 1). Количество клубеньков в варианте опыта с дополнительным внесением ЭПС-белкового комплекса B. japonicum 6346 в фазу бутонизации растений на 62% было выше этого показателя в варианте с полноценными клетками.
Способность клеток штамма B. japonicum 6346, отмытых от экзогликанов, к образованию клубеньков в отборе III была в 1.4 раза меньше по сравнению с неотмытыми - 27.8 и 39.3 клубеньков соответственно. В фазу бутонизации этот показатель при инокуляции отмытыми клетками штамма B. japonicum 6346 находился на уровне значений варианта опыта с полноценными клетками. Однако масса клубеньков в варианте с инокуляцией семян отмытыми клетками бактерий была в 1.4 раза меньше.
Ослабление симбиотических свойств ризобий сои после отмывания экзометаболитов (ЭМ) связано, с удалением высоко- и низкомолекулярных экзогликанов [3], являющихся рецепторными молекулами, связывающими растительный лектин. По-
РОЛЬ ЭКЗОМЕТАБОЛИТОВ В ПРОЦЕССЕ ФОРМИРОВАНИЯ 569
Таблица 2. Влияние бактериальных инокулятов на массу растений сои сорта Марьяна
Фаза одного листа Фаза трех листьев Фаза бутонизации
Вариант масса надземной масса надземной
масса растения части масса корня части масса корня
г % г % г % г % г %
Контроль 1.1 ± 0.1 1.6 ± 0.3 0.9 ± 0.1 7.5 ± 0.3 6.2 ± 0.5
B. japonicum 1.2 ± 0.1 100 1.7 ± 0.2 100 1.3 ± 0.5 100 9.3 ± 0.8 100 4.9 ± 0.5 100
6346
B. japonicum 1.4 ± 0.2 117 2.2 ± 0.3 129 1.3 ± 0.1 100 15.9 ± 1.1 171 12.5 ± 1.0 255
6346 + ЭМ
B. japonicum 1.2 ± 0.2 100 1.7 ± 0.4 100 0.8 ± 0.1 60 9.3 ± 0.8 100 3.2 ± 0.2 65
6346 - ЭМ
видимому, установление межмолекулярных контактов между симбионтами происходило за счет высокомолекулярных компонентов бактериальной клетки, встроенных в клеточную мембрану -липополисахаридов.
Таким образом, на основании анализа способности нативных клеток ризобий и клеток, отмытых от ЭМ, можно заключить, что ризобиальные экзогли-каны в значительной степени определяют клубень-кообразуюшую способность микросимбионта.
Подтверждением этого является факт, что добавление в бактериальный инокулянт надосадочной жидкости, представляюшей собой внеклеточный ЭПС-белковый комплекс [5], приводит к усилению нодуляционной активности штамма-инокулянта.
Анализируя показатели эффективности со-ево-ризобиального симбиоза, одним из критери
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.