БИОХИМИЯ, 2008, том 73, вып. 10, с. 1414 - 1421
УДК 577.218
РОЛЬ ФУНКЦИОНАЛЬНО ЗНАЧИМЫХ МУТАЦИЙ ГЕНА ЬИР1 ВИРУСА ЭПШТЕЙНА-БАРР В АКТИВАЦИИ КЛЕТОЧНЫХ СИГНАЛЬНЫХ ПУТЕЙ*
© 2008 г. С.В. Дидук, К.В. Смирнова, |О.А. Павлиш | , В.Э. Гурцевич**
ГУ Российский онкологический научный центр им. Н.Н. Блохина РАМН, 115470 Москва, Каширское ш, 24; факс: (495)324-1205, электронная почта: gurtsevitch@crc.umos.ru
Поступила в редакцию 15.04.08 После доработки 25.04.08
Латентный мембранный белок (ЬМР1) вируса Эпштейна—Барр является постоянно активированным аналогом клеточного рецептора фактора некроза опухоли ТЫР-Я!. Активируя ряд клеточных сигнальных каскадов, ЬМР1 действует как вирусный онкоген, осуществляя трансформацию В-лимфоцитов человека и фибробластов грызунов. Два специфических мотива, находящихся в составе ЬМР1, ответственны за взаимодействие этого вирусного белка с рецептором Р-ТгСР/Н08 8СР комплекса Е3 убиквитин лигазы, которая участвует в деградации ряда клеточных белков, включая 1кВа — ингибитора ЫР-кВ. В данной работе впервые показано значение точечных мутаций, нарушающих Н08-узнающие мотивы ЬМР1, в активации клеточных сигнальных путей ЫР-кВ, АР1 и Р13К/Ак1. Проведенные исследования также выявили различия в образовании активных форм азота клетками крысиных фибробластов (Иа1;-1), экспрессирующих различные Н08-мутанты ЬМР1. Полученные данные экспериментально подтверждают гипотезу о возможном влиянии отдельных мутаций С-терминального цитоплазматического домена ЬМР1 на трансформирующий потенциал вируса Эпштейна—Барр.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: вирус Эпштейна-Барр, белок ЬМР1, Н08-мутации, ЫР-кВ, N0.
Вирус Эпштейна—Барр (ВЭБ), относящийся к семейству герпесвирусов, характеризуется убиквитарным характером распространения в человеческой популяции и ассоциирован с различными неоплазиями человека, преимущественно лимфоидного и эпителиального происхождения, такими как лимфома Беркита, недифференцированный рак носоглотки, лимфо-ма Ходжкина и рядом других [1—3]. Ген ЬЫР1 входит в небольшое число так называемых генов латентной инфекции, экспрессирующихся в ВЭБ-ассоциированных опухолях, оказывая им-
Принятые сокращения: ВЭБ — вирус Эпштейна-Барр; LMP1 — латентный мембранный белок; CTAR1 — проксимальная трансактивирующая область LMP1; CTAR2 — дистальная трансактивирующая область LMP1; HOS-ре-цептор — рецептор P-TrCP/HOS SCF комплекса E3 убиквитин лигазы; HOS-мотив — последовательность аминокислот для узнавания HOS-рецептором; JNK — c-jun N-терминальная киназа; NO — окись азота; NOS —NO-син-таза; iNOS — индуцибельная NOS; PI3K/Akt — фосфотиди-линозит-3-киназный сигнальный путь.
* Первоначально английский вариант рукописи был опубликован на сайте «Biochemistry» (Moscow), Papers in Press, BM 08-137, 14.09.2008.
** Адресат для корреспонденции и запросов оттисков.
мортализирующее и трансформирующее действие на клетку [4, 5]. Кодируемая этим геном молекула ЬМР1 представляет собой интегральный мембранный белок с молекулярной массой 63 кДа, состоящий из 386 аминокислотных остатков. В его состав входят шесть трансмембранных доменов (162 а.о.) и два цитоплазматичес-ких: короткий Ы-терминальный (24 а.о.) и длинный С-терминальный домены (200 а.о.) [6]. С-терминальный цитоплазматический домен ЬМР1 содержит две трансактивирующих области (СТАЯ). Проксимальная трансактивирующая область СТАЯ1 локализована между аминокислотными остатками 194—232 и ответственна за активацию транскрипционного фактора ЫР-кВ через сигнальный путь ТЯАР3/ШК/1ККа. Дистальная трансактивирующая область СТАЯ2, локализованная между аминокислотными остатками 351—386, является основным индуктором ЫР-кВ, осуществляющим его активацию через сигнальный путь ТКАР6/ТАК1/1ККр [7, 8]. Кроме того, и СТАЯ1-, и СТАЯ2-области активируют ряд других сигнальных путей, в том числе два МАР-киназных пути 8АРК/ШК и р38, а также фосфотидилинозит-3-киназный сигнальный путь (Р13К/Ак11) [9—12]. Механизм
активации этих сигнальных путей, опосредованный LMP1, до конца не выяснен и в последнее время активно изучается, что определено их важной ролью в регуляции ключевых функций клетки, таких как рост и выживаемость, старение и опухолевая трансформация.
Известно, что плейотропное действие LMP1 на различные биологические процессы обусловлено его свойствами, имитирующими свойства членов семейства рецепторов фактора некроза опухоли (TNF-R). Именно с этим свойствами связано влияние вирусного белка на активацию синтеза индуцибельной NO-синтазы (iNOS) и продукцию окиси азота (NO) [13, 14]. NO представляет собой свободный короткоживущий радикал, образующийся во многих типах клеток и имеющий важное биологическое значение. В качестве одного из мессенджеров клетки NO участвует в регуляции систем внутри- и межклеточной сигнализации [15, 16]. Являясь активной формой азота, NO наряду с цитокинами влияет на клеточные эффекторные системы, контролирующие пролиферацию, апоптоз и дифферен-цировку клетки, а также ее устойчивость к стрессовым воздействиям. Внутриклеточный синтез NO осуществляется ферментом NO-син-тазой (NOS). В настоящее время известно три изоформы NOS: нейрональная (nNOS, тип I), индуцибильная (iNOS, тип II) и эндотелиальная (eNOS, тип III). Две из них (nNOS и eNOS) конститутивно экспрессируются в клетке, iNOS образуется de novo как ответная реакция клетки на стресс или в результате действия разного рода клеточных цитокинов [17, 18]. Показано, что уровни экспрессии iNOS и синтеза NO в клетке коррелируют со степенью туморогенности вариантов LMP1 и предположительно связаны с наличием Сао-специфической делеции, локализованной в области CTAR2 LMP1 [19].
Анализ изолятов вируса Эпштейна—Барр из опухолевой ткани больных ВЭБ-ассоциирован-ными заболеваниями в различных географических регионах выявил аккумуляцию ряда значимых мутаций в CTAR-областях молекулы LMP1. Эти мутации оказывают большое влияние на свойства этого белка, изменяя его цитостатичес-кий/цитотоксический статус, а также способствуют усилению его трансформирующего воздействия на клетку [20—23]. К таким часто встречающимся мутациям относят замену глицина на серин в 212-м положении (G212S), се-рина на треонин в 366-м положении (S366T), а также Сао-делецию (делеция 30 п.н.), локализованную в С-терминальном цитоплазматическом домене. Ранее было показано, что все выше перечисленные мутации приводят к нарушению связывания LMP1 с белком рецептором p-TrCP/
HOS SCF комплекса E3 убиквитин лигазы (HOS-рецептором), что усиливает трансформирующую активность LMP1 in vitro, а также нарушает регуляцию сигнальной функции белка NF-kB [24].
Цель данной работы заключалась в выявлении возможного влияния набора HOS-мутаций LMP1 ВЭБ на активацию ряда сигнальных путей (NF-kB, AP1 и PI3K/Akt) и образование NO. Для ее выполнения использовали высокочувствительную модель, основу которой составили клетки крысиных фибробластов Rat-1 и коллекция HOS-мутантов, созданных нами на базе рет-ровирусного вектора. В результате проведенных исследований выяснена роль ряда аминокислотных замен в активации транскрипционных факторов NF-kB, AP1, сигнального пути PI3K/ Akt. Определено влияние этих мутаций на уровень внутриклеточного образования NO, а также показана кинетика его накопления в клеточной культуре Rat-1.
МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Плазмиды. Векторные конструкции pSG5-LMP1-B95-8 и pSG5-LMP1-Cao были любезно предоставлены Ф. Грассером (Homburg, Germany). Варианты гена LMP1, имеющие единичные (G212S, S350A, S366T), двойные (G212S/S350A, G212S/S366T) и тройную замены (G212S/S350A/ S366T, Triple) в HOS-сайтах в составе вектора pSG5 получены от С. Фукса (Pennsylvania, USA). Все выше перечисленные варианты полноразмерного LMP1 переклонированы нами из эука-риотического экспрессирующего вектора pSG5 в ретровирусный вектор pBabe-puro (pBabe). Прототипный вариант LMP1-B95-8 и варианты LMP1 с мутациями в HOS-сайтах клонировали в вектор pBabe по сайтам рестрикции EcoRI. Вы-сокотуморогенный вариант LMP1-Cao клонировали по сайту рестрикции BamHI. Для анализа активации транскрипционного фактора NF-kB использовали репортерную плазмиду kB-ConA-Luc, любезно предоставленную Ф. Грассером. Для проведения анализа активации JNK сигнального пути использовали уип2-люцифераз-ную репортерную плазмиду (AP1-Luc), любезно предоставленную M. Роу (Cardiff, Wales).
Культуры клеток, приготовление ретровирус-ного стока и трансдукция. Все клеточные линии культивировали на среде DMEM с добавлением 10% инактивированной эмбриональной телячьей сыворотки (GIBCO), 2 hM L-глутамина, 100 ед/мл гентамицина и 5% CO2 при 37°. Клетки линии Phi-NX-Ampho Phoenix-A (дериват клеток HEK293) трансфецировали генетическими конструкция-
ми, созданными на основе pBabe-puro с использованием LipofectAMINE Plus («Invitrogen», США) в соответствии с инструкциями производителя. Через 48 ч после трансфекции собирали содержащий вирусные частицы супернатант и центрифугировали его со скоростью 3000 об/мин в течение 5 мин при 4°. Клеточную линию Rat-1 трасдуцировали очищенным от клеточноного дебриса супернатантом в присутствии полибре-на (4 мг/мл) в течение ночи. Селекцию клеток производили пуромицином (5 мг/мл, «Sigma», США).
Получение клеточных лизатов и Вестерн-блот-анализ. Клетки линии Rat-1, постоянно экспрес-сирующие различные варианты LMP1, трижды отмывали в PBS, суспендировали в 200 мкл ли-зирующего буфера (Tris-HCl, рН 6,8, 2% Ds-Na; 10% глицирина; 0,1% p-меркаптэтанола), обрабатывали ультразвуком Ultrasonic Amplifier (Англия) и прогревали при 100° в течение 5 мин. Полученный клеточный лизат осветляли с помощью центрифугирования при 12 000 об/мин в течение 10 мин при 4°. Концентрацию белка в полученном экстракте определяли по методу Брэдфорд [25], поглощение экстракта измеряли на спектрофотометре Junway 6305 (Англия). Разделение белков проводили в 12,5%-ном ПААГ с 0,1% Ds-Na в буфере для электрофореза (25 мМ Tris-HCl; 200 мМ глицин; 0,1% Ds-Na) при силе тока 20 мА. Перенос белков на нитроцеллюлоз-ную мембрану осуществляли с аппаратом для полусухого переноса Fastblot B43 («Biometra», Германия) при напряжении 2,5 мА/см, 4° в течение 30 мин.
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.