РАДИАЦИОННАЯ БИОЛОГИЯ. РАДИОЭКОЛОГИЯ, 2014, том 54, № 5, с. 482-492
== РАДИАЦИОННАЯ ГЕНЕТИКА
УДК [57+61]::539.1.04:57.017.3:595.773.4:595.773.4
РОЛЬ ГЕНОВ РЕПАРАЦИИ ДНК В РАДИАЦИОННО-ИНДУЦИРОВАННОМ ИЗМЕНЕНИИ ПРОДОЛЖИТЕЛЬНОСТИ ЖИЗНИ
БгозоркНа melanogaster
© 2014 г. Л. А. Шилова1, *, Е. Н. Плюснина1,2, Н. В. Земская1, 2, А. А. Москалёв 12,3
Институт биологии Коми НЦ УрО РАН, Сыктывкар 2Сыктывкарский государственный университет, Сыктывкар 3Московский физико-технический институт, Долгопрудный
Исследовали радиоадаптивный ответ и эффект гормезиса по радиационно-индуцированному изменению продолжительности жизни у самцов и самок Вго8орЫ1а melanogaster линии дикого типа Сап-1оп-8 и линий с мутациями в генах ответа на повреждение ДНК (гомолог ОЛБВ45), эксцизионной репарации (гомологи ХРГ, ХРС, РСЫА) и репарации двухцепочечных разрывов ДНК (гомологи ЯЛ054, ХЯСС3, БЬЫ). Адаптирующее воздействие в средних дозах 40 сГр осуществляли хронически на протяжении всех предимагинальных стадий развития, разрешающее острое воздействие 30 Гр применяли на стадии имаго. Также исследовали устойчивость дрозофил к острому воздействию у-излучения с кондиционной повсеместной сверхэкспрессией генов, которые участвуют в распознавании повреждений ДНК (гомологи ОЛБВ45, НПБ1, СНК2), генов эксцизионной репарации ДНК (гомологи ХРГ, ХРС, АР-эндонуклеазы-1) и генов репарации двунитевых разрывов нитей ДНК (гомологи БЯСА2, ХЯСС3, Ки80, ЖЯШехо). В то время как у особей линии дикого типа Сш^оп-Будается наблюдать проявление радиоадаптивного ответа и радиационного гормезиса, у особей с мутациями в генах репарации ДНК радиоадаптивный ответ отсутствует, либо проявляется в меньшей степени, чем у особей линии дикого типа. Мифепристон-индуцибельная активация трансгенов не приводила к повышению устойчивости к острому облучению по продолжительности жизни. Сверхактивация генов репарации ДНК приводила к резкому снижению продолжительности жизни и в отсутствие облучения.
Бго8оркИа melanogaster, репарация ДНК, радиоустойчивость, радиоадаптивный ответ, радиационный гормезис, продолжительность жизни, кондиционная повсеместная сверхэкспрессия.
БО1: 10.7868/80869803114050130
Ионизирующие излучения в малых дозах индуцируют спектр радиобиологических эффектов: гормезис, адаптивный ответ и гиперрадиочувствительность [1]. В последнее время, благодаря исследованиям, выполненным на клеточных культурах in vitro, достигнут большой прогресс в понимании молекулярных механизмов данных эффектов, в том числе у особей излюбленного объекта генетиков — плодовой мушки дрозофилы. Показано, что в формировании эффектов облучения в малых дозах участвуют такие механизмы ответа клетки на стресс как защита от свободных радикалов, репарация ДНК от возникших повреждений, контроль клеточного цикла, апо-птоз. Однако дифференцированный вклад молекулярных и клеточных изменений в эффекты, наблюдаемые на организменном уровне (состояния
* Адресат для корреспонденции: Республика Коми, 167982 Сыктывкар, ГСП-2, ул. Коммунистическая, 28; тел.: (8212) 43-06-50; факс: (8212) 24-01-63; e-mail: lyubov.schilova@yan-dex.ru.
функциональных систем, продолжительности жизни, плодовитости), практически не изучен. В то же время именно эти изменения играют определяющую роль в приспособленности особи и популяции к условиям окружающей среды и являются интегральными показателями здоровья индивидуума.
Ранее нами было установлено, что гормезис, адаптивный ответ и гиперрадиочувствительность влияют на уровне целостного организма Drosophi-1ш melanogaster на изменение таких интегральных показателей как продолжительность жизни [2], а также длительность предимагинального развития [3]. Нами были получены данные, свидетельствующие о том, что реакция на облучение организма определяется клеточными механизмами стрессо-устойчивости (контроль клеточного цикла, обезвреживание свободных радикалов и ответ на тепловой шок) [2, 3]. Под гормезисом мы понимаем стимулирующий эффект воздействия излучений в малых дозах на клетку и организм, а под адап-
тивным ответом — повышение устойчивости клетки или организма к повреждающему действию излучений в больших дозах после предварительного низкоинтенсивного облучения [1].
В данной работе исследовали радиоадаптивный ответ, эффект гормезиса по радиационно-индуци-рованному изменению продолжительности жизни у дрозофил линии дикого типа Canton-S и линий с мутациями в генах ответа на повреждение ДНК (D-GADD45), эксцизионной репарации нуклеоти-дов (mei-9, mus210, mus209), репарации двунитевых разрывов ДНК (okr, spnB, mus309). Также изучали изменения показателей продолжительности жизни у особей с кондиционной повсеместной (мифе-пристон-индуцибельной) сверхэкспрессией генов, которые участвуют в распознавании повреждений ДНК (D-GADD45, Husl, mnk), эксцизионной репарации нуклеотидов (mei-9, mus210), эксцизионной репарации оснований (Rrpl) и генов репарации двунитевых разрывов ДНК по типу гомологичной рекомбинации (Brca2, spnB) и негомологичного воссоединения концов нитей (Ku80, WRNexo) в ответ на острое воздействие у-излу-чения.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДИКА
Линии Drosophila melanogaster. Для проведения экспериментов использовали следующие лабораторные линии Drosophila melanogaster.
— линия дикого типа Canton-S
— линия P{Act5C(-FRT) GAL4.Switch.PR}3/ TM6B, Tbl (обозначена GS-GAL4) — драйверная линия, в присутствии мифепристона повсеместно экспрессирующая транскрипционный фактор дрожжей GAL4, который служит индуктором экспрессии исследуемых трансгенов, находящихся под промотором UAS ("Bloomington Stock Center", США);
— линия w1118, UAS-Brca2 — несет дополнительную копию гена репарации двунитевых разрывов ДНК Brca2 [4—6] под контролем промотора UAS (любезно предоставлена Dr. Schupbach, "Princeton University", Princeton, США);
— линия w1118, UAS-Hus1 — несет дополнительную копию гена сенсора повреждения ДНК Hus1 [7] под контролем промотора UAS, который является составной частью комплекса 9-1-1, необходимого для активации контрольной точки S-фазы клеточного цикла [8] и репарации двунитевых разрывов ДНК по типу гомологичной рекомбинации [9] (любезно предоставлена Dr. Schupbach, "Princeton University", Princeton, США);
— линия w1118, UAS-mnk — несет дополнительную копию ортолога гена сенсора повреждения
ДНК млекопитающих chk2 [10] под контролем промотора UAS (любезно предоставлена Dr. Schupbach, "Princeton University", Princeton, США);
— линия w1118, UAS-D-GADD45 — несет дополнительную копию гена D-Gadd45 под контролем промотора UAS, ортолог данного гена у млекопитающих контролирует активность белков эксцизионной репарации нуклеотидов и оснований ДНК [11] (любезно предоставлена Dr. Uri Abdu, "Ben-Gurion University", Израиль);
— линия w1118, UAS-Ku80 — несет дополнительную копию гена Ku80, под контролем промотора UAS, участвующую в репарации двунитевых разрывов ДНК по типу негомологичного воссоединения концов нитей [12] (созданы с передачей авторских прав под заказ в "Genetivision", Хьюстон, США);
— линия w1118, UAS-mei-9 — несет дополнительную копию ортолога гена эксцизионной репарации ДНК млекопитающих XPF под контролем промотора UAS [13] (созданы с передачей авторских прав под заказ в "Genetivision", Хьюстон, США);
— линия w1118, UAS-mus210 — несет дополнительную копию ортолога гена эксцизионной репарации ДНК млекопитающих XPC под контролем промотора UAS [14] (созданы с передачей авторских прав под заказ в "Genetivision", Хьюстон, США);
— линия w1118, UAS-Rrp1 — несет дополнительную копию ортолога гена эксцизионной репарации ДНК млекопитающих АП-эндонуклеазы-1 [15, 16] под контролем промотора UAS (созданы с передачей авторских прав под заказ в "Genetivision", Хьюстон, США);
— линия w1118, UAS-spnB — несет дополнительную копию ортолога гена репарации двунитевых разрывов ДНК у млекопитающих XRCC3 [10] под контролем промотора UAS (созданы с передачей авторских прав под заказ в "Genetivision", Хьюстон, США);
— линия w1118, UAS- WRNexo — несет дополнительную копию гомолога 3'-5'-экзонуклеазного домена гена репарации двунитевых разрывов ДНК у млекопитающих WRNexo [17] под контролем промотора UAS (созданы с передачей авторских прав под заказ в "Genetivision", Хьюстон, США);
— линия w1 mei-9A1 (обозначена mei-9/mei-9, mei-9/ ) и
— линия w1 mei-9A2/C(1)DX, y1 f1 (обозначена mei-9/+ ) — несут замену аминокислоты в гомологе гена эксцизионной репарации ДНК млекопи-
тающих XPF [13] ("Bloomington Stock Center", США);
— линия mus209B1 b pr cn/CyO (обозначена mus209/+) — несет замену аминокислоты в гомологе гена репарации и рекомбинации ДНК у млекопитающих PCNA [18] ("Bloomington Stock Center", США);
— mus309°3 ry506/TM3, Sb1 ryRK (обозначена: mus309/+) — несет замену аминокислоты в гомологе гена синдрома Блума Blm [19] ("Bloomington Stock Center", США);
— Dp(1;Y)BS, B+; ru1 st1 spnB1 e1 ca1/TM3, Sb1 (обозначена: spnB/+) — несет замену аминокислоты в гомологе гена репарации двунитевых разрывов ДНК у млекопитающих XRCC3 [10] ("Bloomington Stock Center", США);
— линия okrA19-10 cn1 bw1/Cy0 (обозначена: okr/+) — несет замену нуклеотидов в гомологе гена репарации двунитевых разрывов ДНК Rad54 [20] ("Bloomington Stock Center", США);
— линия y*w*; P{GawB}Gadd45NP0351/CyO, P{UAS-lacZ.UW14}UW14 (обозначена: D-Gadd45/ D-Gadd45, D-Gadd45/+) — в кодирующем участке гена D-GADD45 находится инсерция P мобильного элемента ("Kyoto Stock Center", Япония);
— линия mus210G1/Cy0 (обозначена: mus210/+) — несет замену аминокислоты в гомологе гена эксцизионной репарации ДНК у млекопитающих XPC [14] ("Kyoto Stock Center", Япония).
Условия содержания Drosophila melanogaster. Особи содержались термостате при 25° и 12-часовом режиме освещения на стандартной агарно-дрожжевой питательной среде [21].
Активация кондиционной повсеместной сверхэкспрессии генов репарации ДНК. Для сверхактивации генов репарации ДНК использовали RU486-активируемый GeneSwitch [22, 23]. Для получения особей дрозофил с кондиционной (мифепри-стон-индуцибельной) повсеместной сверхактивацией изучаемых генов, самцов линии GS-GAL4, несущих активатор транскрипци
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.