БИОХИМИЯ, 2006, том 71, вып. 5, с. 607 - 614
УДК 577.24
РОЛЬ ИНТЕГРИНОВ СЕМЕЙСТВА 01 В СУБСТРАТЗАВИСИМОМ АПОПТОЗЕ КЛЕТОК КАРЦИНОМЫ МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ, РАЗЛИЧАЮЩИХСЯ ПО МНОЖЕСТВЕННОЙ ЛЕКАРСТВЕННОЙ УСТОЙЧИВОСТИ***
© 2006 г. Г.Е. Морозевич1, Н.И. Козлова1, М.Е. Преображенская1, Н.А. Ушакова1, И.А. Ельцов1, А.А. Штиль2, А.Е. Берман1***
1 ГУ НИИ биомедицинской химии им. В.Н. Ореховича РАМН 119121 Москва, ул. Погодинская, 10; факс: (495)245-0857, электронная почта: berman@ibmc.msk.ru
2 ГУ Российский онкологический научный центр им. Н.Н. Блохина РАМН, 115478 Москва, Каширское ш., 24
Поступила в редакцию 08.11.05 После доработки 06.01.06
Исследована экспрессия интегринов в линии MCF-7 карциномы молочной железы человека и в производной линии MCF-7Dox, клетки которой обладают устойчивостью к нескольким противоопухолевым цито-статикам (множественной лекарственной устойчивостью — МЛУ). Показано, что приобретение карцином-ными клетками МЛУ сопровождается, с одной стороны, резким снижением экспрессии нескольких интег-ринов семейства pi (a2pi, a3pi, a6pi) и интегрина avp5, а с другой — существенным усилением экспрессии интегрина a5pi. Отмечено также, что клетки MCF-7Dox по сравнению с родительскими проявляют высокую устойчивость к субстратзависимому апоптозу (аноикису) и высокую активность в инвазии in vitro. Для выявления роли pi-интегринов в обнаруженных фенотипических изменениях, сопровождающих МЛУ, исследовано влияние активации сигнальной функции («сигналинга») рецепторов этого семейства на анои-кис клеток MCF-7. Усиление сигналинга достигали путем пассирования клеток на иммобилизованные на пластике антитела к pi-субъединице — общей для рецепторов данного семейства. Впервые показано, что стимуляция сигналинга pi-интегринов приводит к значительному усилению аноикиса.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: интегрины, внеклеточный матрикс, аноикис, метастазирование, инвазия.
Лекарственная устойчивость опухолевых клеток — один из главных факторов, препятствующих эффективной химиотерапии рака. Описан феномен множественной лекарственной устойчивости (МЛУ), который заключается в том, что клетки, выживающие при действии одного лекарственного препарата, приобретают устойчивость к другим лекарствам. Среди многочисленных механизмов МЛУ наиболее детально исследован гликопротеин плазматической мембраны с молекулярной массой 140—170
Принятые сокращения: МЛУ — множественная лекарственная устойчивость, поли-ГЭМ — полигидрокси-этилметакрилат, ОТ — обратная транскрипция.
* Ускоренная публикация.
** Первоначально английский вариант рукописи был опубликован на сайте «Biochemistry» (Moscow), Papers in Press, BM 05-250, 02.04.2006.
*** Адресат для корреспонденции и запросов оттисков.
кДа (Р-гликопротеин, Pgp170), транспортирующий из клетки десятки естественных метаболитов и ксенобиотиков, в том числе препараты, используемые при химиотерапии опухолей [1, 2].
Известны и другие механизмы МЛУ, не обусловленные Pgp-зависимым транспортом [3]. Недавно описана резистентность к противоопухолевым агентам при адгезии клеток к белкам внеклеточного матрикса [4—6]. Эти данные указывают на возможное участие в механизмах МЛУ интегринов — матрикс-специфических рецепторов клеточной поверхности, опосредующих взаимодействие клеток с матриксом и проведение сигналов, контролирующих различные внутриклеточные процессы, в том числе связанные с выживанием клеток [7, 8].
Интегрины — большое семейство гетероди-меров, каждый из которых состоит из а- и р-субъединиц, соединенных между собой некова-лентными связями. Многие р-субъединицы мо-
гут формировать димер с различными а-субъ-единицами, на чем основана классификация интегриновых субсемейств (субсемейства р1, Р2, Р3 и др.) [8, 9]. Большинство интегринов обладают перекрестной лигандной специфичностью: каждый рецептор может связывать два и более белков матрикса и каждый белок матрик-са образует комплексы с более чем одним рецептором [8, 9].
Участие интегринов в лекарственной устойчивости может быть обусловлено их ролью в субстратзависимом апоптозе — аноикисе. Механизм аноикиса состоит в том, что интегрины, связанные с внеклеточным матриксом, обеспечивают сигналы, препятствующие гибели клетки, а при нарушении указанных связей клетки подвергаются апоптозу [10, 11]. Предполагается, что этот механизм лежит в основе более высокой резистентности прикрепленных к субстрату клеток по сравнению с резистентностью клеток в суспензии [5, 12, 13].
В ряде работ установлено, что одним из механизмов, определяющих лекарственную устойчивость, является нарушение интегрининдуци-руемых сигнальных путей, контролирующих апоптотическую гибель клеток [14, 15]. Показано, например, что чувствительность некоторых типов опухолевых клеток к цитозару, цисплати-не и камптотецину обусловлена интегринопо-средованной активацией опухолевого супрессо-ра р53, стимулирующего апоптоз, и онкогена с-АЬ1 [14]. Интегрин а4р1 индуцирует резистентность клеток В-клеточного лимфолейкоза к флударабину путем усиления активности анти-апоптотического белка Ве1-хЬ и ингибирования активности р53 [16].
Однако пути передачи интегринопосредуе-мых сигналов, контролирующих апоптоз, требуют дальнейшего изучения. В частности, не ясно, способны ли интегрины передавать только защитный (антиапоптотический) сигнал (сигналы) и обусловлена ли гибель клеток при аноики-се блокированием этого сигнала. Могут ли эти рецепторы при нарушении матрикс-клеточных контактов генерировать проапоптотический сигнал, ведущий к клеточной гибели? На модели растущих в культуре клеток карциномы кишечника нами впервые было установлено, что витронектин-специфический интегрин аур3ге-нерирует сигнал, усиливающий апоптоз, который индуцируется нарушением контакта клеток с субстратом [17]. Способность стимулировать апоптотическую гибель клеток обнаружена и у других интегринов [18, 19]. Следовательно, клетки, не экспрессирующие эти интегрины, обладают более высокой выживаемостью. Возможно, одним из механизмов формирования
лекарственно-резистентной клеточной популяции является отбор клеток, не экспрессирую-щих один (или несколько) таких интегринов. Это предположение подтверждается нашими результатами о значительном снижении экспрессии интегрина avß3 при развитии МЛУ опухолевых клеток [20].
В настоящей работе показано, что клетки аденокарциномы молочной железы человека, приобретающие МЛУ в процессе селекции на выживаемость в присутствии противоопухолевого агента доксорубицина, характеризуются (по сравнению с исходными клетками) резким снижением экспрессии большинства интегри-нов семейства ßl. Клетки с МЛУ проявляют существенно более высокую по сравнению с родительскими клетками резистентность к аноикису и значительно активнее в инвазии in vitro. Впервые установлено, что стимуляция сигнальной активности ßl-интегринов лекарственно-чувствительных клеток приводит к существенному усилению субстратзависимого апоптоза.
МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Реагенты. Моноклональные антитела BHA2.1 к интегрину a2ß1 и P3G8 к av-субъединице, а также поликлональные антитела к цитодоменам субъединиц al, a2, a4, a5, ßl, ß3 и ß5 предоставлены фирмой «Chemicon Int.» (США), моноклональные антитела P1B5 к рецептору a3ß1 — фирмой «Dako Corp.» (США), моноклональные антитела ICO-53 к комплексу гистосовмести-мости HLA-ABC — Ю.А. Барышниковым (ГУ Российский онкологический научный центр им. Н.Н. Блохина РАМН, Москва), N-гидроксисук-цинимидбиотинамидокапроат (NHS-биотин), 3-(4,5-диметилтиазолил-2)-2,5-дифенил-тетра-золий бромид (МТТ) и полигидроксиэтилме-такрилат (поли-ГЭМ) — фирмой «Sigma» (США). Олигодезоксирибонуклеотиды синтезированы фирмой «Syntol» (Москва). Наборы для обратной транскрипции (ОТ) и полимераз-ной цепной реакции (ПЦР) произведены фирмой «Gibco» (США).
Клеточные линии. Линия MCF-7 клеток аде-нокарциномы молочной железы человека получена из ATCC (American Type Culture Collection, США). Вариант этой линии MCF-7Dox, полученный при селекции клеток, выживающих в присутствии доксорубицина, любезно предоставлен Т.Н. Игнатовой (University of Illinois at Chicago, США). Клетки культивировали в среде DMEM, содержавшей 10% сыворотки эмбрионов коров («HyClone», США), 2 мМ L-глутами-на, 100 ед/мл пенициллина и 100 мкг/мл стреп-
томицина, при 37° в атмосфере, содержащей 5% СО2. Клетки MCF-7Dox культивировали в присутствии 1,7 мкМ доксорубицина. Во всех экспериментах использованы клетки в логарифмической фазе роста.
Биотинилирование белков клеточной поверхности, иммунопреципитацию интегринов и электрофорез белков проводили способом, описанным ранее [21]. Иммуноблоты обрабатывали стрептавидин-пероксидазой и проявляли в системе ECL (Enhanced Chemiluminescence) («Amer-sham», Англия).
Реакцию с обратной транскриптазой и полиме-разную цепную реакцию (ОТ-ПЦР) проводили описанным ранее способом [17]. В табл. 1 представлены последовательности праймеров и условия ПЦР для интегриновых субъединиц.
Инвазию определяли в двухкамерных ячейках (Transwell, «Costar») по описанной методике [22].
Аноикис определяли по появлению признаков апоптоза (межнуклеосомной деградации ДНК) при культивировании клеток на неадгезивном субстрате — поли-ГЭМ, приготовленном по описанной методике [23]. Деградацию ДНК определяли с помощью набора «Cell Death Detection ELISA Kit» («Roche Diagnostic GmbH», Германия) согласно рекомендациям фирмы. Метод основан на количественном иммунофер-ментном определении гистонов моно- и олиго-нуклеосом, накапливающихся при фрагментации ДНК.
В опытах по влиянию иммобилизованных антител на аноикис апоптоз определяли по включению радиоактивного тимидина в интакт-ную и деградированную ДНК [24] в нашей модификации. Клетки инкубировали в среде, содержавшей [14С]тимидин (2 мкКи на 2 • 105 клеток), в течение 17 ч при 37°, промывали фосфатным буфером для удаления невключившейся метки и инкубировали 1 ч при 37°. Клетки открепляли ЭДТА-трипсином, суспендировали в среде, содержавшей 2,5% эмбриональной сыворотки, и инкубировали на субстратах из иммобилизованных антител (см. ниже) при 37° в течение 3,5 ч. Затем клетки открепляли обработкой ЭДТА-трипсином, суспендировали
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.