МИКРОБИОЛОГИЯ, 2004, том 73, № 4, с. 437-442
= ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
УДК 579.822.21.017.[732 +735]:577.152.1.05
РОЛЬ ИЗОФОРМ МАЛАТДЕГИДРОГЕНАЗЫ В РЕГУЛЯЦИИ АНАБОЛИЧЕСКИХ И КАТАБОЛИЧЕСКИХ ПРОЦЕССОВ У БЕСЦВЕТНЫХ СЕРОБАКТЕРИЙ БЕваЛТОА ЬЕРТОМШЕОЯМК Д-402
© 2004 г. А. Т. Епринцев*, М. И. Фалалеева*, М. Ю. Грабович*, Н. В. Парфенова*, Н. Н. Каширская*, Г. А. Дубинина**
*Воронежский государственный университет **Институт микробиологии РАН, Москва Поступила в редакцию 13.10.03 г.
Показана функциональная роль тетрамерной и димерной изоформ малатдегидрогеназы (МДГ) в углеродном метаболизме бесцветных серобактерий Beggiatoa 1ер1отШ&гт1з, штамм Д-402, обладающего способностью к лито- и органотрофному росту. С использованием методов ингибиторного анализа доказано, что тетрамерная форма фермента обеспечивает функционирование глиоксилат-ного цикла, а димерная - ЦТК. Установлена динамика перехода димера в тетрамер, обусловленная скоростью окисления тиосульфата. Предполагается, что переключение и регуляция углеродного метаболизма у Beggiatoa leptomitiformis осуществляется благодаря структурно-функциональным изменениям белковой молекулы малатдегидрогеназы.
Ключевые слова: бесцветные нитчатые серобактерии, Beggiatoa, хемолитогетеротрофия, миксот-рофия, малатдегидрогеназа, димер, тетрамер, субъединицы.
Представители группы бесцветных серобактерий широко распространены в водоемах разного типа - пресных, морских, в районах океанических гидротерм и в антропогенных экосистемах. Для них характерно большое разнообразие метаболических путей, варьирующих на видовом и штаммовом уровнях [1-4]. Ранее было показано, что некоторые виды в зависимости от условий культивирования могут менять тип метаболизма от органотрофного до миксо- или автотрофного либо, окисляя соединения серы, не используют ее в энергетическом метаболизме. К факторам, определяющим способ питания, относятся, прежде всего, наличие неорганического донора (соединений серы), кислородный режим и концентрация органического субстрата [5, 6].
В этом отношении Beggiatoa leptomitiformis, штамм Д-402 представляют удобную модель для изучения целого ряда вопросов, связанных с изучением метаболизма и путей его регуляции.
Серный метаболизм штамма Д-402 раньше был подробно исследован при автотрофном, мик-сотрофном и литогетеротрофном росте. Показано, что эти бактерии обладают конститутивными ферментами серного метаболизма диссимилятор-ного типа, получение энергии при использовании серных соединений сопряжено с окислительным фосфорилированием в ЭТЦ. Оказалось, что переход от органотрофного к миксотрофному рос-
ту сопровождается существенной перестройкой углеродного метаболизма [3]. Как известно, ЦТК выполняет в клетках бактерий основную функцию в снабжении ЭТЦ восстановительными эквивалентами в виде НАДН и ФАДН2, синтезируемых при участии соответствующих дегидроге-наз, а также строительным материалом в виде предшественников аминокислот на уровне 2-ок-соглутарата и оксалоацетата. При изучении ферментативной активности ЦТК оказалось, что при переходе от гетеротрофного к миксотрофному росту в клетках миксотрофного штамма Д-402 в несколько раз снижается активность дегидроге-наз вследствие загруженности ЭТЦ потоком электронов от окисляемых серных соединений. Одновременно в 2-3 раза активизируются ферменты глиоксилатного цикла (ГЦ), ответственные за биосинтетические ростовые процессы. Центральное место в функционировании обоих циклов принадлежит малатдегидрогеназе (МДГ, КФ 1.1.1.37) [7].
В связи с тем, что МДГ участвует в работе обоих циклов, важно, как этот фермент регулирует направленность процессов в них. МДГ в клетках эукариот (животные и растения) представлена в виде двух изоферментов - димера и тетрамера, которые различаются по структуре, функциям, локализации и разобщены пространственно. Ранее было показано, что димерная форма МДГ у
эукариот расположена в митохондриях и участвует в энергетических реакциях ЦТК, тогда как те-трамер - в пероксисомах или цитоплазме и участвует в процессах конструктивного метаболизма [7, 8]. Микроорганизмам несвойственны изофер-менты МДГ, и у гетеротрофных бактерий МДГ присутствует в форме димера, а тетрамер найден у анаэробных фототрофов, где он в основном обеспечивает реакции конструктивного метаболизма [9]. МДГ была выделена из клеток Ве^&а-Хоа, выращенных при различных режимах культивирования - в миксотрофных и органотрофных условиях роста. Путем многостадийной очистки был получен ферментный препарат в виде элект-рофоретически гомогенного белка [10].
Ранее нами было показано присутствие в клетках Beggiatoa двух структурных изомеров МДГ -ди- и тетрамера [11], что до сих пор не было известно для прокариотных организмов. Димер обнаружен при органотрофном росте, а тетрамер - при миксотрофном. Анализ кинетических свойств и ин-гибиторный анализ показали их существенное отличие. Однако до конца не было выяснено, какую роль играют димер и тетрамер МДГ в метаболизме Beggiatoa leptomitiformis, штамм Д-402.
Целью наших исследований было изучение роли различных изоформ МДГ в регуляции метаболических процессов у Beggiatoa leptomitiformis, штамм Д-402.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Организм и условия культивирования. Объектом исследования служили пресноводные нитчатые бесцветные серобактерии Beggiatoa leptomiti-formis, штамм Д-402, выращенные органо- и мик-сотрофно.
Для органотрофного выращивания бактерий использовали питательную среду следующего состава (г/л): КаШ3 - 0.620; КаН2Р04 - 0.125; СаС12 ■
■ 2Н20 - 0.030; Ка2Б04 - 0.500; КС1 - 0.125; Mga2 ■
■ 6Н20 - 0.050; пептон - 0.200; лактат - 0.200; дистиллированная вода; рН среды 7.6. Для литотроф-ного роста Beggiatoa leptomitiformis использовали среду того же состава с добавлением Ка2Б203 -2.0. После стерилизации (1 атм) к среде добавляли 10%-ный раствор КаНС03 - 0.125г/л. Перед посевом в среды вносили раствор микроэлементов и витаминов [12].
Суспензию клеток получали путем центрифугирования культур при 8000 g в течение 20 мин. Клетки отмывали 0.05 М трмс-НС1-буфером (рН 8.0) и ресуспензировали в том же буфере.
Методы определения активности ферментов. Активность МДГ, изоцитратлиазы (ИЛ) и изоци-тратдегидрогеназы (ИДГ) определяли ранее описанными методами [13].
Определение общего количества белка проводили по методу Лоури [14]. Количество тиосульфата определяли методом йодометрического титрования.
Очистка и изучение свойств МДГ. Для получения высокоочищенных препаратов МДГ была разработана схема очистки, включающая следующие стадии: получение экстракта фермента, гель-фильтрацию на колонке с сефадексом G-25 ("Pharmacia", Швеция) для освобождения от низкомолекулярных примесей, ионообменную хроматографию на колонке с ДЭАЭ-целлюлозой, элюцию осуществляли ступенчатым градиентом KCl (40-50 мМ). Гель-хроматографию мДг проводили на колонке с сефадексом G-200 ("Pharmacia", Швеция).
Определение молекулярной массы нативного фермента. Для определения молекулярной массы нативной малатдегидрогеназы использовали гель-фильтрацию через сефадекс G-200 [15]. Для этого фермент пропускали через колонку (2 х 45 см), заполненную сефадексом G-200 (сверхтонкий), и измеряли объем его выхода (Ve). Свободный объем (V0) колонки определяли с помощью голубого декстрана. Расчет молекулярной массы изучаемого фермента проводили по формуле:
lg Mr = 6.698 - 0.987(Ve/V0)
Ингибиторный анализ. В опытах использовали следующие ингибиторы: ротенон в концентрации 2 ммоль/л и итаконат в концентрациях 2.5 и 5 ммоль/л, которые добавляли в среду культивирования бактерий.
РЕЗУЛЬТАТЫ
С помощью многостадийной очистки были получены ферментные препараты МДГ из серобактерий Beggiatoa leptomitiformis, штамм Д-402, культивируемых миксотрофно и органотрофно, с удельной активностью 20.4 ± 4.1. Е/мг белка (степень очистки 123) и 24.4 ± 4.8 Е/мг белка (степень очистки 131) соответственно. Было показано, что МДГ из бактерий B. leptomitiformis Д-402 (через 24 ч), выращенных органотрофно, является димером, а в культивируемых миксотрофно - тетрамером. При этом установлено существенное отличие в физико-химических и кинетических характеристиках различных изоформ МДГ (табл. 1). Изменение соотношения изоферментов МДГ из B. leptomitiformis Д-402, культивируемых в условиях миксотрофного роста, в течение разных периодов времени (24, 48, 72, 120 ч), приведено в табл. 2.
Анализ полученных результатов показал, что в первые 24 ч культивирования у B. leptomitiformis Д-402 функционировала только тетрамерная форма фермента, на которую приходилось 100% малатдегидрогеназной активности. Через 48 ч в
Таблица 1. Физико-химические и кинетические характеристики изоформ МДГ из В. leptomitiformis
Изоформы фермента Удельная активность, мкмоль/(мин мг белка) Степень очистки Молекулярная масса, кДа Молекулярная масса субъединиц, кДа Км, мкМ рН-оптимум
Оксалоа-цетат НАДН Малат НАДН+ Оксалоа-цетат Малат
Димер 24.49 ± 131 84 ± 40 ± 56 ± 48 ± 320 ± 120 ± 7.4 ± 9.7 ±
± 0.73 ± 1.5 ± 2 ± 0.15 ± 0.22 ± 12.23 ± 5.90 ± 0.1 ± 0.1
Тетрамер 20.43 ± 123 165 ± 40 ± 20 ± 17 ± 670 ± 530 ± 8.8 ± 10.2 ±
± 0.61 ± 3 ± 2 ± 0.05 ± 0.10 ± 31.14 ± 20.12 ± 0.2 ± 0.2
Таблица 2. Динамика перехода тетрамерной формы МДГ в димерную при миксотрофном росте
Фермент 24 ч 48 ч 72 ч 120 ч
Е % Е % Е % Е %
Тетрамер Димер 2.555 100 1.088 0.652 63 37 0.090 0.597 13 87 0.035 0.244 12.7 87.3
Примечание. Е - мкмоль НАДНДмин мг белка).
клетках присутствовала как тетрамерная, так и димерная МДГ, на что указывают результаты гель-хроматографии через сефадекс 0-200, элюция фермента с которого осуществлялась в виде двух пиков. Содержание данных форм фермента составило, соответственно, 63 и 37%. В дальнейшем доля тетрамера продолжала уменьшаться, а димера - возрастать, и через 5 сут культивирования серобактерий содержание тетрамерной формы составило лишь 12.7%, тогда как количество димерной малатдегидрогеназы достигло 87.3% (табл. 2, рис. 1).
%
120 100 80 60 40 20
8/82032 , мг/л
120 ч
100 80 60 40 20 0
Рис. 1. Динамика соотношения димерной (1) и тетрамерной (2) форм МДГ из В. leptomitifo
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.