БИОФИЗИКА, 2014, том 59, вып. 5, с. 887-894
= БИОФИЗИКА КЛЕТКИ =
УДК 577.3
РОЛЬ КАЛЬРЕТИКУЛИНА В ФУНКЦИОНИРОВАНИИ МИТОХОНДРИАЛЬНОГО АТФ-ЗАВИ СИМОГО КАЛИЕВОГО КАНАЛА
© 2014 г. М.И. Шигаева*, Е.Ю. Таланов*, Н.И. Бенедиктова*, С.В. Мурзаева**, Г.Д. Миронова* **
*Институт теоретической и экспериментальной биофизики РАН,
142290, Пущино Московской области, ул. Институтская, 3; **Пущинский государственный естественно-научный институт, 142290, Пущино Московской области, просп. Науки, 3 Е-mail: shigaeva-marija @ rambler. ru Поступила в p едакцию 24.06.14 г.
Методами MALDI-TOF-TOF и иммунохимического анализа обнаружена гомология аминокислотной последовательности митохондриального калийтранспортирующего белка (м.м. 57 кДа), обладающего свойствами канальной субъединицы митохондриального АТФ-зависи-мого калиевого канала и кальретикулина (м.м. 55 кДа). Проведен ингибиторный анализ АТФ-зависимого транспорта калия в митохондриях с помощью поликлональных антител на кальретикулин. Показано дозо-зависимое ингибирование этими антителами транспорта калия в митохондриях. Максимальная величина ингибирования составила 55-60%. На основании полученных данных выдвинута гипотеза о наличии в митохондриальной мембране как минимум двух типов АТФ-зависимых калиевых каналов. Предположено, что тип митохондриального АТФ-зависимого калиевого канала, в состав которого входит гомологичный кальретикулину белок, локализуется преимущественно в местах контактов митохондриальных и ретикулярных мембран.
Ключевые слова: митохондрии, кальретикулин, митохондриальный АТФ-зависимый калиевый канал, транспорт калия в митохондриях, антитела.
Известно, что ключевую роль в процессе транспор та калия в митохондр иях играют ми-тохондриальные калиевые каналы, из которых наиболее изучен митохондриальный АТФ-зависимый калиевый канал (митоКАтф). Важнейшая роль этого канала в защите тканей от ишеми-ческих повреждений, а также механизмы и регуляция такой протекции в настоящее время интенсивно изучаются многими исследователями. В частности, было показано, что активация митоКАТф-каналов перед продолжительной ишемией миокарда приводит к положительным экспериментальным и клиническим результа-там, таким как сокращение зоны инфаркта и восстановление ритма сер дца [1-4], повышение устойчивости организма к острому гипоксиче-скому стрессу [5,6], а также влияет на энергетический и окислительный обмен [7].
Сокращения: митоКАТФ - митохондриальный АТФ-зави-симый калиевый канал, цитоКАТФ - АТФ-зависимый калиевый канал цитоплазматической мембраны, ДСН - до-децилсульфат натрия, ДНФ - 2,4-динитрофенол.
Однако, несмотря на интенсивное изучение, остается много вопросов относительно структур ы митоКАТФ. Считается, что митоКАТФ по структуре близок к АТФ-зависимому калиевому каналу цитоплазматической мембраны (цито-Катф) и, соответственно, состоит из канальной и регуляторной субъединиц [8-11]. Эти предположения основывались, в первую очередь, на ряде общих для обоих каналов ингибиторов и активаторов. Косвенно это подтверждается данными различных исследователей, изучавших гомологию митоКатф и цитоКатф при помощи иммунохимических анализов с использованием антител к белкам KIR6.X и SUR, являющихся, соответственно, канальной и регулято рной субъединицами цитоКатф различных тканей [12,13]. Подобные данные были недавно получены также и в нашей лаборатории при помощи иммуно-электронной микроскопии с использованием антител к KIR6.2 - канальной субъединице цитоКАТФ [15]. Однако необходимо отметить, что эти данные противоречат данным других авторов, сообщавших об отсутствии конъюгации этих антител с митохондриальны-
ми белками [14]. По данным 1поие, открывшего этот канал [16], и Акоповой [17], в митохондриях существуют, по всей видимости, АТФ-зависимые калиевые каналы как минимум двух типов, отличающийся по действию на них модулятор ов.
Недавно была обнаружена общность мито-КАтф и калиевого канала цитоплазматической мембраны почек, так называемого ROMK-канала [11]. Там же было показано ингибирующее влияние специфического ингибитора этого канала - тертиапина Q - на калиевый транспорт в митохондриях. Однако авторы этой работы также допускают, что в митохондриях могут быть другие типы калиевых каналов.
Пытаясь выяснить структуру канальной субъединицы митоКатф, мы обнаружили высо -кое сходство аминокислотной последовательности выделяемого нами из митохондрий ка-лийтранспортирующего белка-канала м.м. 57 кДа с белком кальретикулином [18]. Для выяснения возможной роли кальретикулина в транспорте калия в митохондриях нами были получены и очищены специфичные поликло-нальные антитела на кальретикулин из печени быка.
О сновной целью данной работы было выяснение роли кальретикулина в образовании К+-транспортирующих каналов в митохондриях. При этом было необходимо получить ответ на основной вопрос - входит ли сам кальре-тикулин или его производные в со став мито-КАТФ-канала, участвует ли этот белок в транспорте калия в митохондриях напрямую.
Обнаруженное ингибирующее влияние антител к кальретикулину на транспорт калия в митохондриях позволило нам выдвинуть гипотезу, что кальретикулин или высокогомологичный ему белок непосредственно входит в состав
митоКАТф.
материалы и методы
Для работы были использованы самцы крыс линии Wistar массой 250-300 г. Все пр оцедуры, проводимые с животными, соответствуют требованиям Декларации C овета Европейского Cоюза 86/609/EEC.
Выделение митохондрий из печени крыс. К рыс декапитир овали, печень извлекали и помещали в предварительно взвешенную и охлажденную ср еду выделения, содержащую 70 мМ сахарозы, 210 мМ D-маннита, 2 мМ ЭДТА, 10 мМ HEPES-NaOH (рН 7,4). Затем печень продавливали через пресс и гомогенизировали в стеклянном гомогенизаторе с тефлоновым пестиком в восьмикратном объеме среды вы-
деления относительно исходной массы ткани. Клеточный гомогенат центрифугировали при 800 g 4 мин, а затем 6 мин при 1200 g. Полученный супернатант центрифугировали 20 мин при 5000 g для осаждения митохондрий. О садок ресуспендировали и промывали в среде, содержащей 70 мМ сахарозы, 210 мМ Б-маннита, 10 мМ НЕРЕБ-КаОН (рН 7,4) и вновь центрифугировали 20 мин при 5000 g. К полученному осадку митохондрий добавляли среду промывания в 0,1-кратном объеме относительно исходной массы ткани и гомогенизировали. Полученная суспензия митохондрий, использовавшаяся в дальнейшей работе, содержала 60-80 мг белка/мл. Концентрацию белка определяли по методу Лоури [19], используя бычий сыворо-точный альбумин (Б СА) в качестве стандарта.
Выделение ретикулюма из печени крыс.
К рыс декапитир овали, печень извлекали и помещали в предварительно взвешенную и охлажденную среду выделения, такую же, как для выделения митохондрий. Печень продавливали через пресс и гомогенизировали в стеклянном гомогенизаторе с тефлоновым пестиком в восьмикратном объеме среды выделения относительно исходной массы ткани. Клеточный гомогенат центрифугировали при 800 g 4 мин, а затем 6 мин при 1200 g. Полученный супернатант центрифугировали 20 мин при 5000 g. Осадок отбрасывали, а супернатант после отделения митохондр ий центр ифугировали 30 мин при 105000 g для осаждения ретикулума. Полученный в р езультате ультрацентр ифугирова-ния осадок ресуспендировали и промывали в ср еде, содер жащей 70 мМ са хар озы, 210 мМ Б-маннита, 10 мМ НЕРЕБ-КаОН (рН 7,4) и вновь центрифугир овали 30 мин пр и 105000 g. К полученному о садку р етикулюма добавляли среду промывания в 0,1-кратном объеме относительно исходной массы ткани и гомогенизировали. Концентрацию белка определяли по методу Лоури [19]. Полученная суспензия ре-тикулюма содер жала 30-40 мг белка/мл.
Выделение и очистка К+-транспортирующего белка м.м. 57 кДа из митох ондрий печени крыс.
С олюбилизацию К+-транспортирующего белка м.м. 57 кДа из митохондр ий печени крыс про -водили методом водно-этанольной экстр акции, разработанным ранее в нашей лаборатории [20], с некоторыми модификациями. Полученные митохондрии разводили 10 мМ тр ис-НС1 буфером (рН 7,4) до концентрации белка 44 мг/мл. К полученной суспензии добавляли 10-кратный объем водного раствора 66% этанола, охлажденного до -20°С, и инкубировали в течение 30 мин при 4°С пр и постоянном перемешива -нии. Полученный экстракт центрифугировали
при 5000 g в течение 20 мин. Осадок отбрасывали, а супернатант диализовали против 5 мМ трис-HCl буфера (рН 7,4) с добавлением 0,05% ß-меркаптоэтанола в течение ночи при 4°C при постоянном перемешивании с одной сменой буфер а через 2 ч после начала диализа. После окончания диализа фракцию центрифугировали при 105000 g в течение 1 ч. Супернатант наносили на колонку ДЕАЕ-сефарозы (Sigma) объемом 1 мл со скоростью 40 мл/ч. Колонка была предварительно уравновешена буфером А, содер жавшим 50 мМ трис-HCl, 0,05% ß-меркаптоэтанола, 1 мМ ЭДТА (рН 7,4). После нанесения фракции колонку промывали двойным объемом этого буфера (2 мл). Связавшиеся белки элюировали с колонки ступенчатым гра -диентом KCl (последовательно 50, 100, 150, 200, 250, 300 и 500 мМ) в буфере А со скоростью 10 мл/ч. После фракционирования белки каждой фракции идентифицировали методом денатурирующего электрофореза в 10% полиакри-ламидном геле в присутствии 0,1% додецил-сульфата натр ия (Д CН) по методу Лэммли [21]. Гели окрашивали кумасси-И250. Исследуемый белок м.м. ~57 кДа элюировался во фракции 250 мМ KCl. Других белков данная фракция не содержала.
MALDI-TOF-TOF-анализ очищенного митохондриального К+-транспортир ующего белка м.м. 57 кДа был проведен в Научно-исследовательском институте биомедицинской химии им. В.Н. Ореховича на договорной основе.
Денатуpиpующий электpофоpез в полиа^и-ламидном геле. Для анализа белков пр именяли систему денатурирующего электрофореза в 10% полиакриламидном разделяющем геле [21] в камер е для вертикального электрофореза (Bio-Rad mini Protean Tetra Systems, CША).
BecTepH-блот анализ. Митохондр ии и рети-кулюм наносили на 10% полиакриламидный гель и проводили электрофорез в денатурирующих условиях [21], используя камеру Mini-рго-tein (BioRad, CША). Нагрузка на трек геля составляла 20 мкг суммарно
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.