БИОЛОГИЧЕСКИЕ МЕМБРАНЫ, 2012, том 29, № 3, с. 165-168
УДК 577.152.1.08
РОЛЬ КАТИОНОВ КАЛЬЦИЯ В МЕХАНИЗМЕ ФИТОХРОМ-ЗАВИСИМОЙ РЕГУЛЯЦИИ ЭКСПРЕССИИ ГЕНА БйН1-2 И АКТИВНОСТИ СУКЦИНАТДЕГИДРОГЕНАЗЫ В ЛИСТЬЯХ КУКУРУЗЫ
© 2012 г. А. Т. Епринцев*, Н. В. Селиванова, Д. Н. Федорин, С. С. Башкин, Е. А. Селезнева, И. В. Дадакина, С. Махмуд Али
Воронежский государственный университет, 394006, Воронеж, Университетская пл., 1;
*электронная почта: bc366@bio.vsu.ru Поступила в редакцию 12.09.2011 г.
После доработки 24.11.2011 г.
Показано, что фитохромная система регулирует активность сукцинатдегидрогеназы и экспрессию ее гена в зеленых листьях кукурузы: красный свет (660 нм) снижает активность сукцинатдегидрогеназы и уровень экспрессии гена sdh1-2. При этом увеличивается содержание катионов кальция в ядерной фракции, что, по-видимому, можно рассматривать в качестве одного из механизмов тран-сдукции фитохромного сигнала в растительной клетке. Дальний красный свет (730 нм) снимал эффекты красного света, в частности, увеличивал активность сукцинатдегидрогеназы и повышал уровень экспрессии гена sdh1-2. Обсуждается возможный механизм световой регуляции на уровне экспрессии функционирования сукцинатдегидрогеназы в зеленых листьях кукурузы с участием фитохромной системы и катионов кальция.
Ключевые слова: сукцинатдегидрогеназа, фитохромная система, активность, экспрессия, световая регуляция, кальций.
Сукцинатдегидрогеназа (СДГ, [КФ 1.3.5.1]), известная как комплекс II, встроена во внутреннюю мембрану митохондрий и является одновременно компонентом электрон-транспортной цепи (ЭТЦ) митохондрий и ферментом цикла Креб-са. Консервативные элементы СДГ-системы, состоящей из четырех полипептидов, представлены двумя периферическими мембранными белками, флавопротеином и железо-серным белком, и двумя мембраносвязанными белками [1]. Известно, что у высших растений комплекс II содержит четыре дополнительных субъединицы с неизвестной функцией [2].
В отличие от комплексов I, III, и IV, изучение множественных генов которых позволило определить функции белковых субъединиц этих комплексов, комплекс II остается малоизученным. Известно, что подавление экспрессии гена sdh1-1 влияет на развитие гаметофита, приводит к нарушению созревания пыльцы и редукции набора семян. Отсутствие гена sdh2-3 замедляет прорастание семян Arabidopsis ЛаНапа [3].
Несомненный интерес для изучения механизмов действия света на ферменты цикла Кребса представляет СДГ, поскольку этот фермент является маркером как цикла Кребса, так и митохондрий в целом. Активность СДГ определяет скорость энергетического метаболизма.
Одним из механизмов световой регуляции активности СДГ может быть участие специальных рецепторных систем растительной клетки, таких как фитохромы и криптохромы. Установлено, что фитохром может либо непосредственно взаимодействовать с молекулой фермента, либо влиять на экспрессию генов [4]. Так, в нашей лаборатории было показано, что активность СДГ и экспрессия ее генов могут регулироваться спектральным составом света [5, 6]
Фитохромная система может обеспечивать контроль за функционированием ферментов, в том числе и мембраносвязанных, влияя на состояние мембраны [7]. Кроме того, фитохром влияет на экспрессию генов через такие мессенджеры, как G-белки, ионы Ca2+ и др. [8, 9].
В представленной работе изучали роль катионов кальция в механизме фитохром-зависимой регуляции экспрессии гена sdh1-2 и активности СДГ в листьях кукурузы.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
В качестве объекта исследования были выбраны растения кукурузы (Zea mays L.) сорта Воронежская 76. Мы использовали зеленые листья 14-дневных проростков кукурузы, выращенных гидропонным способом при температуре 25°С и 16-часовом световом дне.
166
ЕПРИНЦЕВ и др.
св
И 0
.10
У
св д. 0
(U $
О
о «
m
IS
.05
fil
il
fi
il
¿nh
7 6 5 4 3 2 1 0
Свет Темнота КС ДКС КС+ДКС
Й w Ч о
2.0
« 1 и1
Я л 1
So 1
5 ° -а * 1 м s
« « 1 ио Я ft 1
6 8 0 Ко 0
Свет Темнота КС ДКС КС+ДКС
Изменение активности сукцинатдегидрогеназы (темные столбики), уровня транскрипции гена 8йк1-2 (светлые столбики) (а) и содержания катионов кальция в клеточных ядрах (б) из листьев кукурузы, подвергнутых воздействию света с разной длиной волны. Свет — растения, освещенные белым светом. Темнота — растения, выдержанные в темноте. КС — растения, освещенные светом с длиной волны 660 нм. ДКС — растения, освещенные светом с длиной волны 730 нм. КС + ДКС — растения, последовательно освещенные светом с длиной волны 660 и 730 нм.
Белый свет получали от ламп дневного света в установке "Флора-1". Красный (КС) и дальний красный свет (ДКС) получали с помощью свето-диодов с областью испускания 640—680 нм (КИПД40М40-К-П6, Россия) и 710-750 нм (3Л127А-5, Россия). Интенсивность света, равная 0.044 Вт/м2, была достаточной для возникновения сигнальных реакций, связанных с участием фитохромной системы, но не приводит к интенсификации фотосинтеза [10]. Растения подвергали воздействию КС и ДКС в течение 15 мин. Активность СДГ, уровень транскрипции гена sdh1-2 и содержание катионов кальция в ядерной фракции определяли через 30 мин после облучения.
Степень загрязнения ядер определяли при помощи цитоплазматических маркерных ферментов -алкогольдегидрогеназы и лактатдегидрогеназы.
Активность лактатдегидрогеназы определяли при помощи оптического теста Варбурга [11], используя 1 мМ пируват натрия в качестве субстрата.
Активность алкогольдегидрогеназы измеряли спектрофотометрически по скорости восстанов-
ления NAD+ при 340 нм в присутствии 150 мМ этанола [12].
Активность СДГ определяли при помощи метода, основанного на использовании искусственных акцепторов электронов с соответствующим редокс-потенциалом [13].
За единицу ферментативной активности принимали количество фермента, образующего 1 мкмоль продукта за 1 мин при 25°С.
Общее количество белка определяли по методу Лоури [14].
Суммарную РНК выделяли с использованием экстракции смесью гуанидинтиоцианат-фенол-хлороформ и LiCl в качестве осадителя [15].
Обратную транскрипцию мРНК проводили с использованием обратной транскриптазы M-MuLV (СибЭнзим, Россия) согласно инструкции производителя.
Полимеразную цепную реакцию (ПЦР) в реальном времени проводили на приборе Bio-Rad DNA Engine Thermal Cycler Chromo 4 (Bio-Rad, США), используя в качестве красителя SYBR Green I и праймеры к гену sdh1-2: прямой — 5'-CAAACGGGTCACTTCCAACT- 3' и обратный -5 '- CCAAAACTGTCCCACGTCTT- 3 '. Амплификацию проводили в следующем режиме: предварительная денатурация — 95°С, 5 мин; цикл — 95°С, 30 с, 60°С, 30 с, 72°С, 30 с (детекция); заключительная элонгация — 72°С, 10 мин. В качестве отрицательного контроля использовали суммарную РНК без этапа обратной транскрипции.
Фракцию ядер из растительного материала выделяли согласно [16].
Содержание свободного кальция определяли спектрофотометрически по цветной реакции с мурексидом в присутствии глицерина [17].
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Для доказательства возможного участия фитохромной системы в регуляции активности СДГ проростки кукурузы подвергали воздействию низкоэнергетического КС и ДКС, специфично рецептируемых фитохромами. В качестве контроля использовали проростки кукурузы, выдержанные в течение 24 ч в темноте для активации СДГ и снятия всех фитохромных эффектов.
На рис. а изображена зависимость изменения активности СДГ от уровня экспрессии гена sdh1-2 при воздействии света с разной длиной волны. Показано, что на свету и под влиянием КС (660 нм) активность фермента снижалась по сравнению с контролем (24 ч в темноте) в 2.2 и 2.6 раза соответственно. ДКС (730 нм) и последовательное действие КС и ДКС оказывали противоположный эффект. На свету и при облучении растений КС содержание мРНК гена sdh1-2 в образцах было
0
РОЛЬ КАТИОНОВ КАЛЬЦИЯ В МЕХАНИЗМЕ ФИТОХРОМ-ЗАВИСИМОЙ РЕГУЛЯЦИИ
167
значительно меньше, чем в темноте и при воздействии ДКС. Прямая зависимость активности СДГ от уровня экспрессии гена sdh1-2 свидетельствует о том, что изменение каталитической активности СДГ связано с регуляцией синтеза пептидных компонентов каталитического димера СДГ. Анализ полученных данных указывает на существование корреляции между активностью СДГ и уровнем экспрессии гена, кодирующего субъединицу А СДГ, в разных условиях освещения.
Влияние КС и ДКС на уровень транскрипции гена sdh1-2 в растениях кукурузы указывает на то, что именно фитохром принимает участие в регуляции экспрессии гена sdh1-2. Активная форма фитохрома регулирует работу СДГ, влияя на экспрессию генов. В темноте и после последовательного действия КС и ДКС фитохром переходит в неактивную форму. Вероятно, эффективность экспрессии гена СДГ контролируется посредством фитохрома А, так как сходный механизм регуляции выявили ранее у растений А. ЛаНапа [5, 6]. Активная форма фитохрома регулирует синтез СДГ подавляя экспрессию гена, кодирующего субъединицу А СДГ.
Фитохромная система может контролировать функциональную активность клетки, изменяя содержание различных мессенджеров в ядре, таких как О-белки, ионы Са2+ и др. [8]. Подобный механизм регуляции выявили и у нечувствительных к ротенону NADН-дегидрогеназ. Показано, что уровень мРНК этих дегидрогеназ увеличивается после облучения растений КС. Предполагается, что внутримитохондриальная локализация фито-хрома может обеспечивать регуляцию активности NADН-дегидрогеназы и АТР-азы, изменяя содержание Са2+ в матриксе [4].
Показано, что содержание кальция в ядрах клеток растений в условиях разного светового режима коррелирует с функциональным состоянием фитохромной системы (рисунок, б). Установлено, что после облучения растений КС количество кальция в клеточном ядре возрастает по сравнению с количеством, определяемым после 24-часовой инкубации в темноте (рисунок, б). Видно, что через 30 мин после облучения КС количество кальция в ядерной фракции растений возрастало в 1.4 раза. Вероятно, активная форма фитохрома, которая образуется под действием КС, участвует в перераспределении свободного кальция в клетке, увеличивая его концентрацию в ядре. Повышение содержания катионов кальция в ядре коррел
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.