МИКРОБИОЛОГИЯ, 2004, том 73, № 6, с. 725-733
= ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
УДК 579.834.111.[017.73+05]:546.21
РОЛЬ КИСЛОРОДА В РЕГУЛЯЦИИ МЕТАБОЛИЗМА АЭРОТОЛЕРАНТНЫХ СПИРОХЕТ - ОСНОВНОГО КОМПОНЕНТА БАКТЕРИАЛЬНЫХ СЕРНЫХ МАТОВ "ТЫойепйтоп"
© 2004 г. Г. А. Дубинина*, М. Ю. Грабович**, Ю. Ю. Чернышева**
*Институт микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН, Москва **Воронежский государственный университет, г. Воронеж Поступила в редакцию 02.12.02 г.
Два штамма спирохет, выделенные ранее из бактериальных серных матов "ТЫойепйтоп" росли предпочтительно в микроаэробных (м.а.) условиях по сравнению с анаэробными, при содержании растворенного 02 в среде 0.3-0.5 мг/л. Рост в м.а. условиях по сравнению с анаэробными сопровождался двукратным увеличением клеточного урожая и эффективности использования глюкозы, несмотря на дополнительные затраты ростового субстрата и АТФ на синтез экзополисахаридов. Среди продуктов метаболизма глюкозы в м.а. условиях преобладали более окисленные - ацетат и С02, при анаэробном росте - более восстановленные - формиат, этанол, пируват, Н2. Рассматривается адаптационный механизм, позволяющий получать преимущества от использования 02 в процессе, непосредственно не связанном с запасанием АТФ, а именно - использование альтернативного, более эффективного пути катаболизма глюкозы. К защитным механизмам от побочного эффекта использования 02 относятся сверхсинтез экзополисахаридов и окисление восстановленных соединений серы (тиосульфата или сульфида) в качестве антиоксидантов для разрушения избыточной перекиси водорода. Окисление сульфида при взаимодействии с Н202 сопровождается накоплением элементной серы в клетках спирохет. 0бсуждаются условия формирования серных матов с участием аэротолерантных спирохет в солоноводных системах.
Ключевые слова: аэротолерантные спирохеты, "ТЫвйеийтоп", регуляция метаболизма кислородом, ферменты и продукты метаболизма глюкозы, Н202, окисление Н2Б, серные бактериальные маты.
Бактериальные серные маты "Thiodendron", впервые обнаруженные в сульфидных минеральных источниках [1], широко распространены в морских и океанических условиях. Они занимают обширные площади донных отложений в высокопродуктивных регионах с активным поступлением в придонные слои воды сероводорода биогенного или вулканического происхождения и в районах гидротермальной активности [2]. Анаэробные спирохеты с бродильным типом метаболизма, в клетках которых происходит накопление элементной серы, являются основными компонентами серных матов [3]. В отличие от других типов известных сульфурет, формируемых с участием хемоавтотрофных сероокисляющих бактерий, таких, как Beggiatoa, Thioploca и других, образование серных матов "Thiodendron" обусловлено развитием гетеротрофных микроорганизмов [3, 4]. Формирование таких серных матов происходит над поверхностью донных отложений, нередко в придонных слоях морской воды сублиторали в зарослях фукусовых водорослей, где содержание растворенного кислорода варьирует в широком диапазоне. В зоне литорали и сублиторали Белого моря формирование матов "Thiodendron" de novo мы наблюдали дважды в сутки, при смене кис-
лородного режима в момент приливов и отливов с изменениями концентрации кислорода в воде на границе с матом в пределах от 0.01 до 5-7 мг/л [2].
Причины предпочтительного развития анаэробных спирохет в окислительных условиях не были ясны.
В настоящей статье представлены результаты исследований по влиянию кислорода на рост и углеродный метаболизм двух штаммов спирохет, выделенных ранее из серных матов различных водоемов, рассмотрены механизмы адаптации спирохет, обладающих анаэробным типом метаболизма, к росту в присутствии в среде растворенного кислорода, а также вопрос о функциональной роли восстановленных форм серы в метаболизме и механизме накопления элементной серы в клетках.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Штаммы спирохет и условия культивирования.
В работе использованы два штамма спирохет, выделенных нами ранее [3] из серных матов "ТНюйеп-йтоп" соленого источника курорта Старая Русса
(Новгородская обл.) - штамм Р, и с сублиторали Кандалакшского залива Белого моря (Мурманская обл.) - штамм БМ. Оба штамма хранятся в коллекции культур Института микробиологии РАН и в ББ]^.
Для культивирования использовали среду следующего состава (г/л): КаС1 - 20.0; ]ЧН4С1 - 0.3; СаС12 ■ 2Н20 - 0.3; Ы§С12 ■ 6Н20 - 3.0; глюкоза - 1.0; пептон - 1.0, дрожжевой экстракт "БИ^ео" - 0.5; 10%-ный фосфатный буфер, рН 7.6-5.0; витамины и микроэлементы - согласно [3], рифампицин -0.01; в свежепрокипяченную среду перед посевом вносили 0.5 мл 10%-ного раствора Ка2Б ■ 9Н20.
В ряде опытов в качестве восстанавливающего агента в среду вносили Т1(Ш)-цитрат, 50 мМ. Культивирование проводили в 250-мл флаконах под резиновыми пробками при соотношении жидкой и газовой фазы 1 : 10. При анаэробном культивировании флаконы с 25 мл среды после внесения посевного материала заполняли азотом. Микроаэробные условия создавали путем введения воздуха в заполненные азотом флаконы. Конечные концентрации кислорода в газовой фазе составляли 10, 5, 3, 1.4 и 0.5%. Во флаконах с исходным низким содержанием О2 его периодически в ходе развития культуры контролировали газо-хроматографическим методом и в случае необходимости вводили дополнительно воздух до исходной концентрации кислорода. Содержание растворенного кислорода в присутствии сульфида в жидкой среде при внесении 1.4 и 0.5% О2 в газовую смесь определяли модифицированным методом Винклера [5], отбирая 10 мл пробы среды стеклянным шприцем. После выяснения оптимального кислородного режима культивирования спирохет в дальнейшей работе использовали среду с содержанием 1.4% кислорода в газе, что соответствовало 0.4-0.5 мг О2 в 1 л жидкости.
Получение суспензии клеток и бесклеточных экстрактов. Суспензию клеток получали путем центрифугирования культуры при 5000 g в течение 30 мин. После двукратного отмывания в 0.1 М фосфатном буфере (рН 7.5) с добавлением 2% ЙаС1 и 50 мкМ Ка2Б ■ 9Н20 клетки снова осаждали, ресуспендировали в том же буфере, поддерживая соответствующий газовый режим. Клеточные экстракты получали путем разрушения клеток в суспензии с помощью ультразвукового дезинтегратора УЗДН-2Т при мощности 22 кГц в течение 3 мин на ледяной бане, супернатант - после центрифугирования клеточных экстрактов при 9000 g в течение 30 мин при 4°С.
Физиолого-биохимические и аналитические методы. Урожай клеток определяли по белку методом Лоури в конце фазы экспоненциального роста (в двухсуточной культуре). Концентрацию глюкозы в среде определяли спектрофотометри-ческим фенольным методом после удаления кле-
ток центрифугированием при 9000 g [6]. Количество экзополисахаридов также определяли фенольным методом в осадке после центрифугирования культуры при 9000 g и двукратного отмывания осадка буфером.
Продукты метаболизма глюкозы, этанол и ацетат, определяли методом газожидкостной хроматографии на хроматографе Chrom-5 (Чехия). Режим работы хроматографа: газ-носитель - аргон, расход 40 мл/мин, температура испарителя 200°С, объем пробы 5 мкл. Перманентные газы определяли на хроматографе ЛХМ-80 с катарометром. Газ-носитель - аргон, расход 40 мл/мин, ток накала нити 30 мА, температура колонок - комнатная. Другие продукты определяли спектрофотомет-рическими методами: формиат - при длине волны 515 нм [7], пируват - при 505 нм [8], сероводород -при 670 нм [9].
Скорость образования Н202 измеряли люминесцентным методом с люминолом на люминоме-тре ЛБ-3ПА фирмы "Климби" (Россия) в суспензии отмытых клеток (из фазы экспоненциального роста) в 50 мМ фосфатном буфере при рН 7.4 [10]; ка-талазу (2 мкг/мл) и тиосульфат (1 мг/мл) вводили в суспензию непосредственно перед измерениями.
Скорость образования АТФ в суспензии клеток определяли с люциферин-люциферазой на том же приборе [11].
Цитохромы определяли в бесклеточных экстрактах по дифференциальным спектрам поглощения (восстановленный дитионитом минус окисленный воздухом) в области 400-650 нм, при измерении на спектрометре "Pye-Unicam" SP 1800 (Англия).
Ферментативную активность клеток определяли спектрофотометрически на спектрофотометре СФ-26. Активность НАДН-оксидазы, НАДН-пероксидазы (К.Ф. 1.11.1.1) ацетаткиназы (К.Ф. 2.7.2.1) [12], алкогольдегидрогеназы (К.Ф. 1.1.1.1) [13], глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы (К.Ф. 1.1.1.49), гексокиназы (К.Ф. 2.7.1.1), глюко-зо-6-фосфатизомеразы (К.Ф. 5.3.1.9), фруктозо-1,6-бисфосфатальдолазы (К.Ф. 4.1.2.13), фосфог-люкомутазы (К.Ф. 2.7.5.1) - при 340 нм [14], фосфатацетилтрансферазы (К.Ф. 2.3.1.8) - при 233 нм, гидрогеназы (К.Ф. 1.12) - при 600 нм [15].
Все опыты проводили не менее, чем в двух по-вторностях. Результаты представляют средние величины из трех измерений.
Наблюдения за морфологическими измерениями клеток спирохет проводили с использованием фазово-контрастного микроскопа NU-2 фирмы "Zeiss". Элементную серу в клетках идентифицировали с использованием поляризационного микроскопа.
Таблица 1. Зависимость клеточного урожая спирохет, синтеза экзополисахаридов и эффективности использования глюкозы от присутствия кислорода в среде
Условия культивирования Штамм спирохет Длительность опыта (ч) Потребление глюкозы, ммоль/л Накопление белка клеток, мг/л Синтез ЭПС У
мг/л Сэпс/мг
Микроаэробные Р 24 1.1 20.3 но но 18.4
Анаэробные Р 24 1.0 9.4 0 0 9.4
48 1.7 15.0 0 0 8.3
Микроаэробные БМ 48 2.0 29.8 53.2 15.2 14.9 (17.5)*
Анаэробные БМ 48 1.96 14.5 0 0 7.4
Примечание. У - молярный клеточный урожай, мг белка/ммоль глюкозы; но - не определяли.
*Молярный клеточный урожай, рассчитанный на потребленную глюкозу за вычетом ее расхода на синтез ЭПС.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Влияние кислорода на рост и эффективность использования глюкозы
Условия роста в присутствии кислорода.
Для выяснения отношения спирохет к кислороду культивирование обоих штаммов вели в средах без внесения редуцирующих агентов - сульфида натрия или Тьцитрата как в анаэробных, так и в микроаэробных условиях при различном исходном содержании 02 в газовой фазе. Роста спирохет не происходило в отсутствие одного из редук-тантов, даже при
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.