ДОКЛАДЫ АКАДЕМИИ НАУК, 2009, том 428, № 2, с. 272-274
= ФИЗИОЛОГИЯ
УДК 576.32/.36
РОЛЬ КЛЮЧЕВЫХ ФЕРМЕНТОВ ФОСФОИНОЗИТИДНОГО ПУТИ ПЕРЕДАЧИ СИГНАЛА В ДЕЙСТВИИ ОКИСЛЕННОГО ГЛУТАТИОНА И ПРЕПАРАТА ГЛУТОКСИМ НА ВНУТРИКЛЕТОЧНУЮ КОНЦЕНТРАЦИЮ Са2+ В МАКРОФАГАХ
© 2009 г. З. И. Крутецкая, О. Е. Лебедев, Л. С. Курилова, В. Г. Антонов, академик А. Д. Ноздрачёв
Поступило 08.12.2008 г.
В настоящее время значительно повысился интерес к функционированию окислительно-восстановительных систем клеток и влиянию окислителей и восстановителей на различные клеточные процессы в норме и при патологии. Так, фармакологический аналог окисленного глутатиона (0880) препарат глутоксим® ("ФАРМА-ВАМ", Москва) рассматривается как иммуномодулятор широкого спектра действия, который стимулирует процессы кроветворения, активирует системы фагоцитоза, в том числе в условиях иммунодефицит-ных состояний, способствует функциональной дееспособности тканевых макрофагов [1]. В то же время механизмы, опосредующие действие 0880 и глутоксима на клетки, до сих пор практически не изучены.
Ранее нами было показано, что 0880 и глу-токсим увеличивают внутриклеточную концентрацию Са2+, [Са2+]^ вызывая мобилизацию Са2+ из тапсигаргинчувствительных Са2+-депо и последующий вход Са2+ в перитонеальные макрофаги крысы [2—4]. Кроме того, с использованием двух структурно различных ингибиторов тиро-зинкиназ (генистейн, метил-2,5-дигидроксицин-намат) и ингибитора тирозинфосфатаз ортована-дата На нами впервые выявлено участие тирозин-киназ и тирозинфосфатаз в действии 0880 и глутоксима на [Са2+] в макрофагах [3—5]. Полученные данные позволяют предположить участие как рецепторных, так и цитоплазматических ти-розинкиназ в сигнальном каскаде, запускаемом 0880 и глутоксимом. Кроме того, с использованием двух структурно различных ингибиторов фосфатидилинозитолкиназ вертманнина и соединения ЕУ294002 нами впервые показано участие фосфатидилинозитол-3- и фосфатидилино-зитол-4-киназ в действии 0880 и глутоксима на [Са2+] в макрофагах крысы [6].
Санкт-Петербургский государственный университет
В перитонеальных макрофагах идентифицированы рецепторы с собственной тирозинки-назной активностью, содержащие в экстраклеточных доменах участки богатые цистеином [7], которые могут являться мишенями для 0880 и глутоксима. Активация этих рецепторных тиро-зинкиназ может приводить в действие белки, содержащие 8Н2-домены, такие как фосфолипаза Су, цитоплазматические тирозинкиназы семейства 8гс и фосфатидилинозитол-3-киназа, и запускать сигнальные каскады, например фосфоинози-тидный путь передачи сигнала [7, 8]. Известно, что важнейшие компоненты фосфоинозитидной системы фосфолипаза С и протеинкиназа С имеют высокую редокс-чувствительность и их активность модулируется окисляющими и восстанавливающими агентами [9, 10]. В связи с этим представлялось целесообразным исследовать также возможную роль ключевых ферментов фосфо-инозитидного пути передачи сигнала фосфоли-пазы С и протеинкиназы С в регуляторном действии 0880и глутоксима на [Са2+] в макрофагах.
Для выявления участия фосфолипазы С в действии 0880 и глутоксима на [Са2+] в перитоне-альных макрофагах крысы мы исследовали влияние ингибитора фосфолипазы С неомицина [11] на Са2+-ответ, вызываемый 0880 или глутокси-мом. Для исследования роли протеинкиназы С в действии 0880 и глутоксима использованы специфические ингибиторы протеинкиназы С — соединение Н-7 [12] и кальфостин С [13]. Подробно процедура культивирования макрофагов и автоматизированная установка для регистрации [Са2+] с использованием флуоресцентного зонда Бига-2АЫ описаны ранее [14]. Эксперименты проводили при комнатной температуре 20—22°С на 2—3 сут культивирования клеток. На рисунках представлены результаты, полученные для глутоксима (100 мкг/мл). Аналогичные данные были получены при использовании 0880 (100 мкг/мл).
Показано, что инкубация макрофагов в течение 20 мин с 100 мкг/мл глутоксима вызывает су-
РОЛЬ КЛЮЧЕВЫХ ФЕРМЕНТОВ ФОСФОИНОЗИТИДНОГО ПУТИ
273
[Са2% нМ 500 г
(а)
Глутоксим
250
Са2+
10
15
20
25
500
250
Неомицин (б) Глутоксим Са2+
1 1 1 ^ Лиг1 1 1 1 1
500 г
250 -
10 15
20
25
30
35
500
250
30
0 5 10 15 20 25 30
Время, мин
Рис. 1. Влияние неомицина, соединения Н-7 и кальфостина С на эффект глутоксима на [Са2+]| в перитонеальных макрофагах. Каждая регистрация получена для группы из 40—50 клеток и представляет собой типичный вариант для 3—7 экспериментов. а—г — см. в тексте.
щественное повышение [Са2+]ь отражающее мобилизацию Са2+ из внутриклеточных Са2+-депо. Добавление в наружную среду 2 мМ Са2+ индуцирует вход Са2+, обусловленный, по-видимому, опустошением Са2+-депо (рис. 1а). Предварительная инкубация клеток с 50 мкМ неомицина в течение 10 мин до введения 100 мкг/мл глутокси-ма практически полностью предотвращает повышение [Са2+] и вход Са2+, вызываемые глутокси-мом (рис. 1б). Предварительная инкубация макрофагов с 100 мкМ соединения Н-7 в течение 10 мин до введения 100 мкг/мл глутоксима также приводит к практически полному подавлению увеличения [Са2+]ь вызываемого глутоксимом, и предотвращает вход Са2+ из наружной среды (рис. 1в). Сходные результаты получены с использова-
нием другого ингибитора протеинкиназы С кальфостина С в концентрации 1 мкМ (рис. 1г).
Таким образом, нами впервые показано участие ключевых ферментов фосфоинозитидного пути передачи сигнала фосфолипазы С и протеинкиназы С в регуляторном действии 0880 и глутоксима на [Са2+] в перитонеальных макрофагах крысы.
На основании результатов, полученных в настоящей работе и ранее [2—6], можно предположить, что 0880 и глутоксим трансактивируют рецепторы с собственной тирозинкиназной активностью и запускают комплексный сигнальный каскад, включающий тирозинкиназы, тиро-зинфосфатазы, фосфатидилинозитолкиназы, а также важнейшие ферменты фосфоинозитидной
274
КРУТЕЦКАЯ и др.
системы фосфолипазу С и протеинкиназу С, что приводит к увеличению [Ca2+] в макрофагах.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Жуков О.Б., Зубарев А.Р., Мезенцева М.В. и др. // Врачебное сословие. 2004. Т. 5/6. С. 51—56.
2. Крутецкая З.И., Лебедев О.Е., Курилова Л.С. и др. // ДАН. 2007. Т. 412. № 5. С. 700-703.
3. Курилова Л.С., Крутецкая З.И., Лебедев О.Е. и др. // Цитология. 2008. Т. 50. № 5. С. 452-461.
4. Kurilova L.S., Krutetskaya Z.I., Lebedev O.E. et al. // Cell and Tissue Biol. 2008. V. 2. P. 322-332.
5. Крутецкая З.И., Лебедев О.Е., Курилова Л.С. и др. // ДАН. 2007. Т. 417. № 2. С. 273-275.
6. Крутецкая З.И., Лебедев О.Е., Курилова Л.С. и др. // ДАН. 2008. Т. 422. № 4. С. 562-563.
7. CorrellP.H., Morrison A.C., LutzM.A. // J. Leukoc. Biol. 2004. V. 75. P. 731-737.
8. Lutz M.A., Correll P.H. // J. Leukoc. Biol. 2003. V. 73. P. 802-814.
9. Gopalakrishna R., Jaken S. // Free Rad. Biol. Med. 2000. V 28. P. 1349-1361.
10. Mangat R., Singal T., Dhalla N.S. et al. // Amer. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 2006. V. 291. P. 854-860.
11. Lipsky J.J., Lietman P.S. // J. Pharmacol. and Exp. Ther. 1982. V. 220. P. 287-292.
12. Kawamoto S., Hidaka H. // Biochem. and Biophys. Res. Communs. 1984. V. 125. P. 258-264.
13. Kobayashi E., Nakano H., Morimoto M. et al. // Bio-chem. and Biophys. Res. Communs. 1989. V. 159. P. 548-553.
14. Крутецкая З.И., Лебедев О.Е., Тюшев В.Е. и др. // Цитология. 1997. Т. 39. № 2/3. С. 164-176.
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.